辅助生殖技术对出生性别的影响：囊胚移植增加ICSI周期出生性别比

高红婧，师娟子，解晋琳，马嫣，蔡贺*

(1.西安医学院，西安 710021；2.西北妇女儿童医院生殖中心，西安 710000)

自1978年第1例试管婴儿诞生以来，辅助生殖技术(ART)在国内迅速发展。中华医学会生殖医学分会数据报告[1]显示，仅2018年度ART助孕出生婴儿共204 688名，较2017年度增多22 528名。伴随ART出生婴儿比例增加，ART可能影响子代出生性别比的问题也令人担忧。出生性别比(secondary sex ratio，SSR)一般定义为活产男婴与女婴的比值[2-3]。许多大样本数据研究表明，特定的ART技术可能对SSR造成影响[3-7]：与体外受精(IVF)技术相比，卵胞浆内单精子注射(ICSI)降低了SSR；而囊胚移植相较于卵裂胚移植，其SSR增高。但是也有文献报道，移植囊胚对SSR不会产生明显影响[8-11]。Weston等[9]回顾性研究表明，囊胚培养不会改变后代性别比，这可能是延长胚胎培养时间至囊胚期虽然增加了男性胚胎的比例，但ICSI降低了男婴出生比例，产生和囊胚移植相反的作用效果，最终中和了这种偏倚。而Dumoulin等[12]表示，经ICSI处理后，后代为男性的囊胚中包含的细胞明显多于女性的，但是在常规受精的囊胚中并没有发现该差异。此外，评估囊胚形态和染色体相关性的研究表明，SSR与囊胚形态学评分相关[13-14]。Ebner等[14]报道认为，男婴的滋养层细胞(TE)为A级者是女婴囊胚的2.53倍，然而该研究样本量小，其结果需大样本研究进一步证实。

鉴于目前囊胚培养及移植的趋势不断上升[15-17]，其可能对性别比例失衡的长期影响是一个重大的公共卫生问题[18-20]。因此，本研究目的是评估我中心单胚胎移植(single-embryo transfer，SET)后成功分娩的新生儿SSR，并比较不同助孕方式及移植囊胚形态评分对新生儿性别的影响。

资料与方法

一、研究对象

回顾性队列研究分析2015年1月至2019年12月在本中心接受IVF/ICSI-ET助孕、行SET且成功分娩的患者和新生儿临床资料。纳入/排除标准：于本中心接受IVF/ICSI-ET助孕患者；SET后成功分娩者；排除临床资料缺失患者。

二、研究方法

1.IVF/ICSI助孕过程：根据患者年龄及卵巢功能个体化选择激动剂或拮抗剂等方案[21]促排卵，动态监测卵泡发育以及血清生殖激素水平，当有3个或3个以上卵泡直径≥18 mm时，肌肉注射HCG(珠海丽珠制药)10 000 U或皮下注射重组HCG(艾泽，默克，意大利)250 μg诱导排卵，注射HCG后32～36 h取卵。采用常规IVF或ICSI授精。

2.胚胎质量评估：按Peter卵裂期胚胎评分系统并结合本中心实际工作评估D3胚胎质量[3]，将胚胎质量分为5级：Ⅰ级(D3胚胎8～10细胞，卵裂球均匀，胞质均匀透亮，透明带完整，胚胎无碎片或<10%碎片)、Ⅱ级(D3胚胎6～7细胞或>10细胞，卵裂球稍不均，碎片10%～20%，透明带完整)、Ⅲ级(D3胚胎4～5细胞，卵裂球稍不均，碎片20%～50%，透明带完整)、Ⅳ级(碎片>50%，卵裂球不均)。Ⅲ级及以上级别胚胎为可用D3胚胎，Ⅰ级、Ⅱ级为优质D3胚胎。

将可用D3胚胎转移至G2培养皿微滴(Vitrolife，瑞士)中培养至第5～6天，观察囊胚形成情况并记录，按Gardner分级标准[22]对所形成囊胚进行评分。根据囊胚的扩张和孵出程度将囊胚分为6级：1级(早期囊胚，囊胚腔小于胚胎体积的1/2)、2级(囊胚腔超过胚胎体积的一半)、3级(完全囊胚，囊腔充满整个胚胎)、4级(扩张期囊胚，囊腔扩张，直径大于最初的胚胎直径，透明带变薄)、5级(正孵出囊胚，即胚胎正从透明带中孵出)、6级(已孵出的囊胚，囊胚完全从透明带中孵出)。根据内细胞团(ICM)和滋养外胚层细胞(TE)的发育情况进行以下评分标准，即ICM评分：A级(细胞数目多，结合紧密)、B级(细胞数目较少，结合较松散)、C级(细胞数目极少)；TE评分：A级(细胞数目多，囊胚四周均有细胞分布)、B级(细胞数目较少，上皮细胞较松散)、C级(细胞数目极少)。囊胚扩张3级及以上且ICM及TE评分均≥C级定义为可用囊胚，其中ICM及TE评分均≥B级定义为优质囊胚。

3.胚胎移植及黄体支持：新鲜周期择优移植1枚D3卵裂胚或D5囊胚；冻融移植周期复苏胚胎后行单卵裂胚或单囊胚移植。移植后黄体支持为本中心常规黄体支持方案，即阴道置入黄体酮缓释凝胶(雪诺同，默克，瑞士)1.125 g/d+口服地屈孕酮(达芙通，雅培，荷兰)30 mg/d，或阴道置入黄体酮软胶囊(安琪坦，法杏，法国)600 mg/d+口服地屈孕酮30 mg/d。

移植后第28天阴道B超检查可见宫内孕囊为临床妊娠，之后定期随访患者的孕产期情况及其分娩后子代结局。

4.观察分析指标：主要结局指标为出生性别比(SSR)，即活产男婴与女婴的比值。活产定义为胎龄≥28周的活胎分娩。对SSR的统计与分析中，每对同卵双胞胎计为一个活产儿。

三、统计分析

结 果

一、患者周期资料

本研究共纳入6 922个活产SET周期。其中，单胎活产6 782周期，同卵双胎活产140周期(男胎80周期，女胎60周期；同卵双胎计为一个新生儿)。

6 922个活产SET周期中，男婴组3 793周期，女婴组3 129周期，SSR为121.2。男婴组与女婴组间母亲年龄、不孕因素构成、精子来源比较均无统计学差异(P>0.05)；而男婴组与女婴组间受精方式、周期类型、移植胚胎类型比较有统计学差异(P<0.05)(表1)。

表1 活产儿中男婴组与女婴组的一般资料比较[(-±s)，n(%)]

二、SSR影响因素的单因素分析

1.受精方式：IVF组SSR较ICSI组显著升高(126.4 vs. 107.8，P=0.004)。

2.移植胚胎类型：囊胚移植组SSR较卵裂胚移植组显著升高(125.1 vs. 104.8，P=0.005)。

3.周期类型：新鲜移植周期SSR略高于冻融移植周期，但并无统计学差异(127.3 vs. 114.0，P>0.05)。

三、SSR影响因素的多因素分析

将单因素分析中有统计学差异的指标纳入多因素分析，结果显示：与卵裂胚比较，囊胚移植显著增加SSR(OR=1.20，P=0.004)；与IVF周期比较，ICSI周期显著降低SSR(OR=0.86，P=0.007)；新鲜或冻融胚胎移植对SSR的影响在矫正了混杂因素后，关联并不显著(P=0.43)(表2)。

表2 婴儿SSR影响因素的Logistic回归分析

四、胚胎类型结合受精方式分层分析

根据受精方式对胚胎类型进行分层分析：IVF囊胚移植 vs. IVF卵裂胚移植；ICSI囊胚移植 vs. ICSI卵裂胚移植。结果表明：囊胚移植只增加ICSI周期中SSR(OR=1.44，P=0.002)，对IVF周期中SSR无显著影响(OR=1.10，P=0.185)(表3)。

表3 单胚胎移植后新生儿SSR的分层分析(受精方式+胚胎类型)

五、囊胚形态学评分对SSR的影响

对受精方式分层分析后显示，IVF组中A、B以及C级TE的占比分别为5.0%、69.4%和25.6%，ICSI组中A、B以及C级TE的占比分别为3.6%、62.3%和34.1%。其中ICSI组的C级TE比例显著高于IVF组(34.1% vs. 25.6%)。因此，矫正了受精方式后，对囊胚形态学参数(囊胚形成时间、扩张度、ICM和TE分级)与SSR的关系进行了分析。结果表明：TE评分高与SSR增高有关，TE评分A或B的囊胚较评分C者产生更高比例的男性后代[OR=1.76(A vs. C)；OR=1.28(B vs. C)，P<0.001]；而囊胚形成时间、扩张度以及ICM评分对SSR均无显著影响(P>0.05)(表4)。

表4 囊胚形态学分级对SSR影响的Logistic回归分析(校正受精方式后)

讨 论

本研究发现与卵裂胚移植相比，延长胚胎培养至囊胚期会增高出生性别比(SSR)，然而此种影响与受精方式有关，在ICSI周期中囊胚移植和卵裂胚移植相比SSR显著增加，但在IVF周期中未发现此影响。囊胚形态学评分中，TE质量对SSR的影响具有更加重要的意义。

有研究认为，男性胚胎较女性胚胎具有更快的发育速度[5]，解释了为什么囊胚移植增加出生男婴性别比。Maalouf等[15]研究表明，调控葡萄糖摄取、代谢的G6PD基因和抗氧化的HPRT 基因位于X染色体上，因此，雌性胚胎较雄性胚胎会摄取更多的葡萄糖并需要抵御更高的氧化应激损伤，进而导致胚胎发育速度缓慢。本研究结果显示，ICSI周期的囊胚移植较卵裂胚移植SSR显著升高(115.5 vs. 80.5，P=0.002)；但IVF周期的囊胚移植后的SSR较卵裂胚移植并无显著差异(128.8 vs. 116.5，P=0.185)。ICSI技术作为一种非生理性的受精过程，越过了正常受精中精子层层筛选环节，人为挑选精子进行授精，而不育男性携带Y染色体精子往往会存在形态学异常，这就造成了ICSI助孕过程中精子的选择偏倚[20]。本研究考虑到精液来源和男性不孕因素的影响，我们调整混杂因素后，ICSI仍然明显降低SSR。Luke等[5]也认为，ICSI引起SSR降低的机制可能不在于男性因素，而是与ICSI技术本身有关。Yu等[23]报道，精子注射过程可能会损伤卵母细胞内DNA复制单元，从而造成胚胎性别发育的异常有关。

囊胚形态学评分分析发现，囊胚扩张度高(5～6)和TE评分高(A/B)的囊胚移植后的SSR显著升高，表明囊胚形态学可能在某种程度上预测SSR。与IVF组相比，ICSI来源的囊胚C级TE占比更高(34.1% vs. 25.6%)。我们推测，ICSI来源的囊胚增高SSR的原因可能是ICSI的操作过程诱导TE质量下降，女性囊胚损失更多，造成男婴比例升高。目前机制仍不完全清楚。既往研究支持，两条X染色体中的一条异常失活可能部分地导致女性在受精后早期提前死亡[24]。Dumoulin等[12]发现，ICSI来源的女性囊胚较男性囊胚的TE细胞数量明显减少，而IVF来源的囊胚未观察到这种效应。ICSI操作后的女性囊胚可能比男性囊胚更容易发生TE的异常，TE后续会发育为胎盘部分，TE细胞数目减少将影响胚胎植入和进一步发育的潜力。

自1992年ICSI技术诞生以来，其在ART治疗中所占比例不断增加[6，25-26]。2010年国际监测辅助生殖技术委员会(ICMART)对60个国家进行的ART助孕横断面研究表明，ICSI比例达63.0%[25]。本研究中ICSI的比例为26.2%，与国内报道数据(29.2%)[26]大致相当，比例远低于欧洲(71.3%)[27]和美国(56.4%)[6]。一方面是由于女性不孕因素占多数原因，另一方面，我国ICSI技术需要有明确指征，主要用于严重的男性因素或IVF受精失败。ICSI技术对出生性别的影响越来越受到关注，ICSI助孕的远期预后仍在追踪和不断观察[28]，也提示我们ICSI技术需要严格把握适应证。

本研究是单中心回顾性研究，对研究结果的解释受到研究设计的限制，存在选择偏倚可能，未来需要多中心、大样本的研究来阐明其潜在的机制。

综上所述，囊胚移植增加ICSI治疗后新生儿的出生性别比；囊胚形态评分中，TE质量对出生性别的影响具有更加重要的意义。