应用单核苷酸多态性微阵列芯片及核型分析检测7例21q部分三体的产前遗传学诊断

孙丹，王小艳，罗曼曼，陈群，甘露露，高萍，宋婕萍*

(1.武汉金域医学检验所有限公司，武汉 430056；2.湖北省妇幼保健院 检验科，武汉 430070)

21三体综合征又称唐氏综合征(DS)，是由于生殖细胞减数分裂过程中21号染色体不分离所导致的一种最常见的染色体病，在新生儿中的发病率为1/700～1/800。该综合征在产前通常可表现为颈项透明层(NT)增厚、颈项软组织厚度(NF)增厚、鼻骨异常、左心室强光斑、股骨或肱骨短小、心脏畸形、侧脑室增宽等，出生患儿主要表现为中重度智力低下、特殊面容及其他各种先天性畸形等[1-3]。而21号染色体部分三体在临床上较为罕见，最早由Ilbery等[4]报道，是一种罕见的异常综合征，因重复片段大小和位置不一，临床表现异质性强，部分携带者可完全正常，部分患者可表现为典型的21三体综合征，迄今为止仅存在200余例相关病例报道。目前资料显示21三体综合征的临床表型主要由定位于21q22区的唐氏综合征关键区域(down syndrome critical region，DSCR)决定，其长度约为0.6～8.3 Mb[5]。

目前21号染色体部分三体报道较少，本研究联合应用染色体核型分析、染色体微阵列分析(CMA)技术对无创产前基因检测(NIPT)提示21三体或部分三体高风险或B超提示异常的胎儿进行产前诊断，并对父母进行遗传学分析，评估再发风险，额外增加了7例部分21三体综合征的病例，为21q部分三体染色体结构与功能之间的联系提供新的依据，也为临床遗传咨询提供依据。

一、资料与方法

1.研究对象：7例NIPT提示21三体或部分三体或B超提示异常的胎儿。孕妇平均年龄31岁，平均孕周为22 W+，均有生育史，生育小孩均发育正常。7对夫妻否认近亲婚配，且家族成员均无类似病史。标本采集及检测均经过患者及家属知情同意。孕妇信息详见下表：

2.方法：胎儿羊水标本采集：在B超引导下对孕妇行经腹羊膜腔穿刺术，抽取30 ml羊水，其中20 ml用于染色体核型分析，另10 ml用于产前CMA检测。

核型分析检测：取20 ml羊水，按常规操作进行羊水细胞培养、收获、制片和胰酶显带。染色体异常的分析和描述标准依照《人类细胞遗传学国际命名标准2016版》。

表1 孕妇信息

产前CMA检测：取10 ml羊水。参照Affymetrix cytoscan 750 k芯片标准操作流程进行消化、连接、扩增、纯化、片段化、标记、杂交、洗染、扫描，15 d出具结果。结果判断依据DGV、Decipher、omim、clinvar等数据库，根据美国医学遗传学学会与基因组学学会(ACMG)和临床基因组资源中心(Clingen)共识建议对拷贝数变异进行分类，共分为5个等级：致病性(pathogenic，P)、可能致病性(likely pathogenic，LP)、临床意义不明(variant of unknown significance，VOUS)、可能良性(likely benign，LB)、良性(benign，B)，仅报道前3种类型。

短串联重复序列(pSTR)：采用STR对标本进行母血污染鉴定。

二、结果

1.CMA检出的染色体结果及核型结果：7例孕妇羊水标本CMA均检测成功。其中6例胎儿仅存在21号染色体的部分重复，有1例样本除21号染色体的部分重复外，还存在17号染色体短臂末端的1.6 Mb的缺失。拷贝数变异判定结果显示，4例为临床意义不明拷贝数变异，3例被判定为致病性拷贝数变异。该7例样本中有3例样本因孕周大于26周无法进行羊水培养，未做核型分析检测，其余4例行核型分析的样本中有2例核型分析检测结果因重复片段较小未见异常，2例检测为阳性结果，其中1例为嵌合核型(表2)。CMA结果见图1。

图1 7例羊水样本CMA结果细节图

2.妊娠结局与父母验证结果：通过对7例患者详细的遗传咨询，1号孕妇重复区域包含过往报道的21三体关键区域，同时因已育有一胎正常小孩选择终止妊娠，又因后续无生育需求，选择不做父母验证。3号孕妇因前次也出现胎儿心脏畸形且生育过一胎正常小孩而选择了终止妊娠，也拒绝做父母验证。4号孕妇因携带有2个拷贝数变异且致病性较为明确而选择直接终止妊娠，同样也因育有一个正常孩子而放弃做父母验证。2、6、7号孕妇在进行父母验证之后，发现胎儿携带的拷贝数变异均遗传自母亲，在详细评估了孕妇的表型后，该3例孕妇均选择了继续妊娠，随访后发现小孩均无可见异常，无DS表型。其中7号孕妇及胎儿携带重复区域较大，但孕妇及出生后胎儿表型均无异常，可排除该区域的重复是21三体综合征的关键区域的可能性。而5号孕妇在未进行父母验证的情况下选择B超随访并继续妊娠，且随访发现胎儿出生3个月以后复查心脏无异常。具体可见表2。

表2 CMA结果及妊娠结局

三、讨论

人类21号染色体全长48 Mb(hg19)，包含469个基因，编码基因约有222个[6]。目前已知有41个孟德尔遗传基因(omim)疾病相关的基因，涉及智力障碍、孤独症、癫痫、阿尔茨海默症、耳聋、先天畸形、血液病等多种疾病。目前报道与DS表型相关的基因有30多个，其中DSCR1和DYRK1被认为是其中最重要的两个基因。DYRK1表达的增加与神经退行性疾病和肿瘤的发生相关[7]；DYRK1基因重复与DS典型的面部畸形等临床特征相关，当其缺乏时与神经细胞数目引起的智力低下相关，该基因的纯合功能性突变是胚胎致死性的。DSCR1基因在神经发育中起重要作用，该结论在小鼠模型中得到了证实[8-9]。然而，仅包含该基因重复的病例报道较为罕见，该关键区域的具体定位仍然存在争议，如Eggermann等[10]认为DSCR1基因重复不足以引起典型的DS表型。除以上两个基因外，与DS有关的基因文献报道如下：SOD1基因重复在一个18个月具有典型DS的患儿中被报道，作者认为该基因是DS的一个候选基因[11-12]；Barlow等[13]认为DSCAM基因重复与DS的心脏缺陷相关，通常仅表现为法洛四联症，而当其合并COL6A1基因重复时，可能还会合并心脏房室管缺陷等；APP基因重复导致大脑中的血浆淀粉样蛋白-β(Aβ)增多，被证实与DS引起的阿尔茨海默症密切相关[14-15]。本案例中3号孕妇嵌合重复的片段包含大量功能基因，未包含以往报道的关键区域，胎儿临床表现为心脏畸形，而心脏畸形的病因极为复杂，可能由环境因素和遗传因素或两者共同作用引起，由于夫妻双方并未做父母验证，该拷贝数变异内包含的基因是否是引起胎儿心脏畸形的原因还有待进一步研究。

目前CMA技术已广泛应用于产前诊断，作为一项高分辨检测人类全基因组范围内DNA重复或缺失的方法，除了能够检测出主要染色体的非整倍体，也能检测出<10 Mb的小片段拷贝数变异，是传统核型分析的有效补充，相较于传统的核型分析可多检测出一些染色体异常的胎儿，有助于降低出生缺陷，提高人口素质。同时还具有无需羊水培养、检测周期短、运用软件分析从而减少主观判断降低人为偏差等优势，是产前对于无创提示染色体异常、高龄孕妇、B超异常等诊断指征的一线检验方法[16]。然而在检测过程中，可能会检测出大量临床意义未明的拷贝数变异，根据最新拷贝数变异临床指南，对拷贝数变异的解读依赖于片段包含的基因及个数、过往报道的病例及本地数据库的完善及父母验证信息等，因此同道之间特殊病例的共享显得尤其重要。

通常在产前遗传咨询过程中，孕妇选择进行父母验证来明确一些临床意义未明的拷贝数变异的来源，并通过详细评估父母的表型来确定该拷贝数变异的临床意义，会对该拷贝数变异提供有价值的信息；同时过往的病例报道对拷贝数变异的评估具有十分重要的作用。本研究报道了7例21号染色体部分三体的病例，表明21部分三体有多种形式，重复片段大小不一，临床表型异质性较大，可能表现为完全正常或仅有轻微的症状，也可能有典型的DS的表型。在NIPT提示21三体高风险或B超提示与DS表型相关的异常时，应联合应用多种技术对胎儿进行产前诊断。本研究结论与过往的报道结论相吻合，并进一步证实了21号染色体关键区域可能位于21q22的较小区域内，这对以后的产前21号染色体部分三体的遗传咨询具有重大意义。