蛋白酶体抑制剂乳胞素对大鼠黑质多巴胺能神经元氧化损伤的作用

潘 琪,王子珍,叶富跃,邢 伟,林家汉,卢剪月,杨 堃

（1.海南医学院第一附属医院神经外科，海南 海口570102；2.海南医学院第一附属医院康复医学科，海南 海口570102）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见于中老年人的神经系统变性疾病，以静止性震颤、运动缓慢、肌强直和姿势步态障碍为症状特征，以黑质多巴胺能神经元变性和纹状体内多巴胺严重减少为病理学特征，其发病机制尚未完全清楚［1-2］。研 究［3］显 示：泛 素-蛋 白酶 体 系 统 受 损 与PD的发生有密切关系。泛素-蛋白酶体系统是细胞中重要的非溶酶体蛋白质降解系统，参与细胞中大多数蛋白质的降解［4］。蛋白酶体抑制剂能够诱导多巴胺能神经元退变和包涵体形成，类似于PD的病理特征，但其中的机制尚未完全明确［5-6］。早期研究［7-9］显示：氧化损伤可能是导致PD神经元死亡的重要因素之一。体外研究［10］显示：抑制蛋白酶体会导致细胞出现氧化损伤。但相关研究较少，且体内抑制蛋白酶体对黑质多巴胺能神经元的氧化损伤作用尚不明确。本研究采用立体定向手术将蛋白酶体抑制剂乳胞素注射入大鼠黑质中，于注射后不同时间点检测大鼠中脑黑质中的羟自由基、还原型谷 胱 甘 肽 （glutathione， GSH）、 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白质羰基和8-羟基脱 氧 鸟 苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）等氧化损伤指标及黑质中多巴胺能神经元退变情况，探讨体内氧化损伤在蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元死亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器健康雄性SD大鼠70只由海南医学院实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（琼）2017-0013，体质量200～250 g，室温22℃±2℃，光线12 h明暗交替，自由饮水饮食。所有操作均符合实验动物伦理学要求。乳胞素、小鼠抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）单克隆抗体和阿扑吗啡购自美国Sigma公司，免疫组织化学检测试剂盒（SP-9002）和DAB显色试剂盒（ZLI-9032）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，羟自由基测试试剂盒、GSH测定试剂盒、MDA测定试剂盒、蛋白质羰基水平测定试剂盒和8-OHdG测试盒购自南京建成生物工程研究所。大鼠立体定向仪（51603型）购自美国Stoelting公司，图像分析系统（NIKON 801图像分析系统）购自日本尼康公司，冰冻切片机（CM 1900）购自德国Leica公司，酶标仪（Synergy H 1M）购自美国Bio-Tek公司。

1.2 动物分组和黑质乳胞素注射将70只SD大鼠随机分为乳胞素组和生理盐水组，每组35只，经反复行为检测确认其无旋转行为后进行实验。3.5%水合氯醛（350 mg·kg－1）腹腔注射麻醉动物后固定在立体定向仪上，齿杆较耳杆低2.4 mm，确定各组大鼠右侧黑质致密部为前囟后5.2 mm，矢状缝右侧2.2 mm，硬膜下7.2 mm，切开颅部皮肤，小型磨钻钻开颅骨，按已确定的坐标将微量注射器缓慢进针至预定深度，注射2μL乳胞素10μg（生理盐水溶解），注射速度为0.5μL·min－1，留针5 min，缓慢退针，缝合切口。生理盐水组大鼠按照相同方法注射等体积的生理盐水。

1.3 旷场实验检测2组大鼠运动能力干预后21 d行旷场实验检测2组大鼠运动能力［11］。旷场实验箱：黑色敞口木箱，大小为60 cm×60 cm×40 cm，箱底划为25个方格（12 cm×12 cm），将大鼠置入正中一格，10 s后开始记录15 min内2组大鼠各项行为指标。总跑动时间：大鼠躯干处于水平位置时向前后或两侧运动的时间；下肢站立次数：双前肢抬起离地1 cm以上的次数；穿梭距离：规定时间内跑动的格子数（二爪以上跨入邻格为跑动1格）；实验在17：00～22：00进行，实验室内暗光、安静，2次实验之间将箱底打扫干净。

1.4 不对称实验检查大鼠行为能力将大鼠置入透明塑料圆柱筒（直径20 cm，高30 cm）中，录像记录大鼠在筒内的行为。测试时间为10 min。在暗光环境下进行测试［12］。测试完成后，由不了解大鼠状况的研究人员通过录像对大鼠行为进行记分和评分。评分方法为计算不对称指数，不对称指数=（同侧触壁次数+1/2双侧触壁次数）/（同侧触壁次数+对侧触壁次数+双侧触壁次数）。

1.5 阿扑吗啡诱导旋转实验检测各组大鼠运动行为旷场实验后进行阿扑吗啡诱导旋转实验［13］。大鼠皮下注射阿扑吗啡（0.25 mg·kg－1）后置于圆形测试容器中，10 min后开始观察大鼠旋转行为的改变，记录30 min内大鼠的对侧旋转圈数。

1.6 黑质氧化损伤指标检测干预后第3、7和21 d，采用8%水合氯醛（400 mg·kg－1）对大鼠进行深度麻醉，快速断头取脑，在冰台上分离出新鲜黑质，采用4℃PBS冲洗除去残余血液，在干冰上用滤纸拭干，立即置于－80℃超低温冰箱备用。取组织块采用4℃PBS漂洗，滤纸拭干，准确称质量，采用眼科剪快速剪碎组织块，按质量（g）：体积（mL）=1∶9的比例，加入4℃预冷的生理盐水中，组织匀浆器充分匀浆，3 000 r·min－1、4℃离心15 min，将离心好的匀浆取上清弃去下面沉淀。羟自由基、GSH、MDA、蛋白质羰基和8-OHd G水平检测的具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 黑质TH免疫组织化学染色和神经元计数干预后 21 d，8% 水合氯醛深度麻醉（400 mg·kg－1）大鼠，然后将大鼠固定于实验板上。充分暴露心脏，持针头刺入左心室，剪开右心耳，快速灌注生理盐水，300 mL/只，将灌注液更换为4%多聚甲醛400 mL。断头取脑，采用4%多聚甲醛后固定6 h。冰冻切片，片厚30μm。按免疫组织化学检测工作液试剂盒说明行TH免疫组织化学染色。小鼠抗TH一抗稀释比例为1∶1 000。每只大鼠取前囟后－4.8 mm、－5.2 mm和－5.6 mm的切片各1张，共3张切片，然后对两侧黑质的TH免疫阳性神经元进行计数。黑质多巴胺能神经元毁损程度采用黑质中TH免疫阳性神经元残存率表示，残存率越低，毁损程度越高。每只大鼠黑质中TH免疫阳性神经元残存率为毁损侧与健侧的TH免疫阳性神经元百分率。

1.8 统计学分析采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。2组大鼠旋转圈数、穿梭距离、下肢站立的次数、总跑动时间和羟自由基、GSH、MDA、蛋白质羰基及8-OHdG水平分布符合正态分布，以±s表示，组间两两比较采用LSDt法。2组大鼠不对称指数和神经元残存率以±s表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 旷场实验检测2组大鼠运动能力干预21 d后，乳胞素组大鼠跑动减少、运动缓慢，穿梭距离明显低于生理盐水组（P＜0.05）。乳胞素组大鼠15 min内下肢站立次数与生理盐水组比较亦明显减少（P＜0.05）。生理盐水组大鼠跑动活跃，平均有近一半的时间均在跑动，而乳胞素组大鼠跑动较少，总跑动时间较生理盐水组减少（P＜0.05）。见表1。

表1 2组大鼠旷场实验相关指标Tab.1 Indicators of open field test of rats in two groups

2.2 2组大鼠行为能力干预21 d后，生理盐水组大鼠前肢使用不对称指数为0.51，位于0.5附近，表明大鼠对两侧前肢的使用无偏好。乳胞素组大鼠前肢使用不对称指数为0.81，明显大于0.5，表明大鼠偏好使用毁损同侧肢体。与生理盐水组比较，乳胞素组大鼠前肢使用不对称指数明显升高（t=－11.155，P＜0.05）。

2.3 2组大鼠旋转行为表现干预21 d后，乳胞素组大鼠注射阿扑吗啡后出现恒向健侧旋转，表现为以健侧后肢为支撑点，头尾相接，身体弯曲成环状的快速旋转行为。第3、7和21天30 min内大鼠旋转圈数分别为（17.9±11.3）、（27.6±18.8）和（260.4±22.2）圈，与生理盐水组比较差异有统计学意义（P＜0.05），第21天大鼠旋转圈数较前2次（第3天和第7天时）的旋转圈数明显增多（P＜0.05），而第7天大鼠旋转圈数与第3天的旋转圈数比较差异无统计学意义（P=0.239）。生理盐水组大鼠注射阿扑吗啡后无旋转行为。

2.4 2组大鼠黑质氧化损伤指标干预7和21 d后，与生理盐水组比较，乳胞素组大鼠右侧黑质中羟自由基水平明显升高（P＜0.05），而GSH水平明显降低（P＜0.05）。干预7和21 d后，与生理盐水组比较，乳胞素组大鼠右侧黑质中MDA、蛋白质羰基和8-OHd G水平明显升高（P＜0.05）。干预3 d后，2组大鼠右侧黑质中羟自由基、GSH、MDA、蛋白质羰基和8-OHd G水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2和3。

表2 不同时间点2组大鼠右侧黑质中羟自由基和GSH水平Tab.2 Levels of hydroxyl radical and GSH in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

表2 不同时间点2组大鼠右侧黑质中羟自由基和GSH水平Tab.2 Levels of hydroxyl radical and GSH in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group.

表3 不同时间点2组大鼠右侧黑质中MDA、蛋白质羰基和8-OHd G水平Tab.3 Levels of MDA,protein carbonyl and 8-OHdG in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

表3 不同时间点2组大鼠右侧黑质中MDA、蛋白质羰基和8-OHd G水平Tab.3 Levels of MDA,protein carbonyl and 8-OHdG in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group.

2.5 2组大鼠黑质中TH免疫阳性神经元残存率干预21 d后，生理盐水组大鼠两侧黑质中均有大量的TH免疫阳性神经元。乳胞素组大鼠毁损侧（右侧）黑质中TH免疫阳性神经元明显丧失。生理盐水组和乳胞素组大鼠黑质中TH免疫阳性神经元残存率分别为（98.48%±3.16%）和（10.91%±1.77%）。与生理盐水组比较，乳胞素组大鼠黑质中TH免疫阳性神经元残存率明显降低（t=59.263，P＜0.05）。乳胞素组大鼠毁损侧黑质中TH免疫阳性神经元数较对侧平均减少约89.09%。见图1。

图1 2组大鼠黑质中TH免疫组织化学染色情况（Bar=1 mm）Fig.1 TH immunohistochemical staining in substantia nigra of rats in two groups(Bar=1 mm)

3 讨 论

本研究结果显示：将蛋白酶体抑制剂乳胞素注射入大鼠黑质后，黑质中羟自由基、MDA、蛋白质羰基和8-OHd G水平明显升高，而GSH水平明显降低。组织中羟自由基和GSH水平是反映组织氧化还原状态的常用标志物［14-15］。大鼠黑质中注射乳胞素后第7和21天，黑质中羟自由基水平明显升高，而GSH水平明显降低，表明乳胞素诱导大鼠黑质组织出现严重的氧化应激反应。MDA、蛋白质羰基和8-OHdG分别是脂质、蛋白质和DNA氧化损伤的常用生物标志物［16-17］。大鼠黑质内注射乳胞素后第7和21天，MDA、蛋白质羰基和8-OHd G水平均出现明显升高，表明乳胞素诱导黑质内脂质、蛋白质和DNA均出现严重的氧化损伤。这些发现与先前的多项体外研究结果一致。抑制蛋白酶体可以导致NT-2细胞和SK-N-MC细胞氧化损伤，包括蛋白质、脂质和DNA的氧化损伤水平升高及GSH水平降低［18］。有研究［19］显示：抑制蛋白酶体可引起神经元和星形胶质细胞的DNA和RNA的氧化损伤。有研究［18］显示：蛋白酶体抑制剂诱导的氧化损伤早于细胞死亡，提示蛋白酶体抑制剂通过诱导神经元氧化损伤，从而导致神经元死亡。蛋白酶体抑制剂诱导神经元氧化损伤的机制尚不完全明确，可能与氧化损伤的蛋白质降解减少、线粒体功能受损和铁离子失稳态等有关［20-21］，还需要进一步研究。本研究中，在注射乳胞素第3天时大鼠黑质组织中未检测出氧化应激标志物的明显改变，提示体内抑制蛋白酶体诱导神经元氧化损伤需要较长的时间。

本研究结果显示：2μL、5 g·L－1蛋白酶体抑制剂乳胞素单侧黑质内微量注射可以导致大鼠黑质中TH免疫阳性神经元大量丧失。TH是多巴胺能神经元的常用标志物，黑质中TH免疫阳性神经元大量丧失反映出黑质内多巴胺能神经元大量死亡。乳胞素组大鼠毁损侧黑质内TH免疫阳性神经元数较对侧平均减少约89.09%，表明2μL、5 g·L－1乳胞素单侧黑质内注射可以达到严重毁损一侧黑质-纹状体多巴胺能神经通路。乳胞素组大鼠在旷场测试中表现出明显的运动减少和运动缓慢症状，在前肢采用不对称测试中偏好使用毁损同侧肢体，在阿扑吗啡诱导旋转实验中注射阿扑吗啡后出现恒向健侧旋转，表明这些类似于PD的运动障碍表现能够被相关行为学测试检测出。以上研究结果支持蛋白酶体抑制剂可以用于PD动物模型的建立。

综上所述，大鼠黑质中注射蛋白酶体抑制剂可以诱导大鼠多巴胺能神经元氧化损伤和死亡，大鼠能够表现出类似于PD的运动障碍表现，氧化损伤在蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元死亡中起重要作用。