幽门螺杆菌对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药率及其相关耐药基因突变特征

宋顺佳,王鑫莹,姜菲菲,贾慧建,赵 远,杨志平,孙丽媛,赵云冬

（1.北华大学医学技术学院分子生物教研室，吉林 吉林 132013；2.北华大学附属医院消化内科，吉林 吉林 132011）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种有鞭毛的微需氧革兰阴性杆菌，消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃肠道疾病已被证实与Hp感染高度相关［1］。1994年，世界卫生组织将Hp列为Ⅰ类致癌因子［2］。根除Hp可促进消化性溃疡愈合，并可明显降低胃癌和胃淋巴瘤发病率［3］。Hp感染主要发生在儿童时期，一旦感染，除非经过抗生素治疗，否则很难自愈［4］。临床上常用于治疗Hp的几种常见抗菌药物有克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林和四环素等，但是随着临床上抗生素的广泛应用，我国Hp根除率越来越低，Hp对几种常见抗菌药物产生耐药性是导致其感染治疗失败的主要原因，并且多重耐药菌株的出现，也给其根除治疗带来极大的困难［5-6］。若在治疗前进行Hp耐药性检测可以最大限度地减少低效抗菌药物的使用和药物不良反应及降低抗生素耐药性。由于Hp分离培养困难，近年来，从分子水平研究Hp耐药机制引起国内外学者的广泛关注。有研究［7］显示：相关耐药基因突变是导致Hp对抗生素产生耐药性的重要机制之一，如23S rRNA基因Ⅴ区上的点突变与克拉霉素耐药相关；氟喹诺酮类药物与gyrA基因所在的喹诺酮类耐药决定区 （quinolone resistance determining region，QRDR）突变有关；甲硝唑耐药主要与rdx A基因突变有关，但其突变位点多样，尚未发现一致位点。由于Hp耐药机制复杂，目前尚无明确的定论，因此，检测相关耐药基因突变位点对Hp耐药机制的研究具有重要意义。

本研究采用琼脂稀释法检测Hp对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星3种常见抗生素的耐药性，通过测序探讨相关耐药基因23S rRNA、rdxA和gyrA的突变形式，有助于高效、快速和准确地检测Hp抗生素耐药性，本研究旨在阐明Hp耐药机制，为指导临床合理用药、提高Hp根除率和有效控制Hp耐药菌株的传播提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2020年9月—2021年5月在北华大学附属医院消化内科就诊的35例患者胃黏膜标本。纳入标准：碳13尿素呼气试验（Carbon 13 Urea Breath Test，13C-UBT）证实Hp感染阳性；经内镜检查确诊为消化道溃疡或慢性胃炎；从未接受过根除Hp治疗；签定知情同意书。排除标准：近4周服用过抗生素、铋剂和非甾体类抗炎药者；对本次治疗所用药物有过敏史者；全身有重大疾病者；胃癌或有胃部切除手术史者；有精神疾病，不能配合检查者；孕期及哺乳期者。

1.2 主要试剂和仪器哥伦比亚琼脂培养基、无菌脱纤维绵羊血、Hp选择性添加剂和微需氧产气包均购自青岛海博生物技术有限公司，2×Taq PCR Master Mix、D2000 DNA Ladder、细菌基因组DNA提取试剂盒和普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星购自上海源叶生物科技有限公司。Anoxomat MarkⅢ厌氧培养系统购自广东省广州市尤德生物科技有限公司，MJX-160B-Z型霉菌培养箱购自上海博讯实业有限公司，ETC 811型PCR基因扩增仪购自苏州东胜公司，JY 300E电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司，紫外凝胶成像自动分析仪购自美国Biorad公司，微量核酸蛋白测定仪购自美国Thermo公司，高压蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械厂。

1.3 Hp分离培养和鉴定胃黏膜标本经充分研磨后制成组织匀浆，接种至含Hp选择性添加剂的哥伦比亚血琼脂培养基上，无菌接种环涂布均匀，置于37℃、微需氧环境（5%O2、10%CO2、85%N2）中培养3～5 d。观察菌落形态，经革兰染色、生化反应（氧化酶试验、尿素酶试验和触酶试验）及扩增16S rRNA基因鉴定Hp。

1.4 药敏试验采用琼脂稀释法将以倍比稀释的不同浓度抗菌药物分别加入含10%无菌脱纤维绵羊血的M-H血琼脂培养基中，混匀后正置待凝固。药物琼脂平板终浓度分别为0.031 25、0.062 50、0.125 00、0.250 00、0.500 00、1.000 00、2.000 00、4.000 00、8.000 00、16.000 00、32.000 00和64.000 00 mg·L－1。各个平板划分4个扇区，每个扇区分别接种1株菌。挑取典型菌落研磨至0.9%NaCl溶液中，配制为2麦氏比浊的菌悬液，吸取2～3μL菌液，分别滴加于上述平板，此外各菌株接种于无抗生素的平板上作为对照。置于37℃、微需氧环境培养3 d后记录结果。以抑制细菌生长的最低药物浓度作为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。参考相关文献［8-9］，克拉霉素的MIC≥1.0 mg·L－1定义为耐药菌株，甲硝唑的MIC≥8.0 mg·L－1定义为耐药菌株，左氧氟沙星的MIC≥1.0 mg·L－1定义为耐药菌株。

1.5 基因组DNA的提取采用细菌基因组DNA试剂盒提取Hp基因组DNA，采用微量核酸蛋白测定仪检测待测DNA浓度，以波长260 nm处吸光度（A）值和波长280 nm处A值的比值A（260）/A（280）鉴定DNA纯度，每个样品重复测定3次，取平均值。将得到的DNA原液稀释至约100 mg·L－1，置于－20℃保存。

1.6 特异性引物的设计从美国国立生物技术信息 中 心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库获取特异性基因16S rRNA和耐药基因23S rRNA、rdx A及gyrA目的基因序列，采用DNAMAN分子生物学软件设计特异性引物，NCBI Primer BLAST评估引物特异性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，特异性引物的序列见表1。

表1 特异性引物的序列Tab.1 Sequences of specific primers

1.7 PCR扩增反应优化PCR反应体系和反应参数，16S rRNA和rdxA最适PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物（10 mg·L－1）各0.5μL，DNA模板（100 mg·L－1）1μL，无菌ddH2O将体积补足至25μL；23S rRNA和gyrA最适PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物（10 mg·L－1）各1μL，DNA模板（100 mg·L－1）1μL，无菌ddH2O将体积补足至25μL。最适PCR反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.8 PCR产物检测取4μL PCR产物点样于1.5%琼脂糖凝胶上，85 V电泳85 min，停止电泳。将凝胶置于紫外分析仪中观察，拍照。

1.9 PCR产物纯化首先向吸附柱CA 2中加入500μL平衡液BL，12 000 g、1 min，弃去废液；从琼脂糖凝胶中切取目的DNA条带，置于干净Ep管中，称质量；切胶后Ep管中加入等倍体积溶液PN，封口膜封好，50℃水浴至胶块充分溶解；所得溶液加入另一吸附柱CA 2中，室温静置2 min，12 000 g、60 s，倒废液；加600μL漂洗液PW，室温静置2～5 min后12 000 g离心60 s，倒废液（重复1次）；12 000 g空转2 min，室温放置数分钟，彻底晾干；吸附柱CA 2置于另1支干净Ep管中，向吸附膜中间悬空滴加30μL ddH2O，室温放置2 min，12 000 g离心2 min，收集DNA液体，重复1次，提高DNA回收量。

1.10 耐药基因测序和比对将PCR纯化后产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。从NCBI数据库获取Hp 26695标准菌株的23S rRNA、rdxA和gyrA基因序列，采用DNAMAN和Clustal X 2.0分子生物学软件将耐药基因23S rRNA、rdxA、gyrA序列测序结果与Hp 26695标准菌株序列进行比对，分析核苷酸和氨基酸序列突变位点。

2 结 果

2.1 Hp菌株的鉴定将Hp菌株培养3～5 d后，平板上可见光滑、半透明和针尖样的小菌落（图1）；镜下可见典型的呈S形、螺旋状或弧形的革兰阴性菌（图2）；氧化酶试验、尿素酶试验和触酶试验结果均为阳性；Hp菌株扩增特异性16S rRNA基因，均于182 bp处出现单一特异明亮条带（图3）。

图1 Hp菌落的形态表现Fig.1 Morphology of Hp colonies

图2 镜下Hp菌落的形态表现（HE，×1 000）Fig.2 Morphology of Hp colonies under microscope（HE，×1 000）

图3 部分Hp菌株16S r RNA基因PCR产物电泳图Fig.3 Electrophoregram of PCR product of 16S r RNA gene of some Hp strains

2.2 菌株的耐药情况实验室35株Hp菌株均对甲硝唑和左氧氟沙星产生耐药，28株对克拉霉素耐药，耐药率为80%。见表2。

表2 35株Hp对3种抗生素的耐药率Tab.2 Drug resistance rates of 35 strains of Hp to three antibiotics

2.3 耐药基因的扩增将克拉霉素耐药基因23S rRNA、甲硝唑耐药基因rdxA和左氧氟沙星耐药基因gyrA经PCR扩增后，于425、851和530 bp处出现单一特异明亮条带，结果与预期相符。见图4～6。

图4 部分Hp菌株23S r RNA基因PCR产物电泳图Fig.4 Electrophoregram of PCR product of 23S r RNA gene of some Hp strains

图5 部分Hp菌株rdx A基因PCR产物电泳图Fig.5 Electrophoregram of PCR product of rdx A gene of some Hp strains

图6 部分Hp菌株gyr A基因PCR产物电泳图Fig.6 Electrophoregram of PCR product of gyr A gene of some Hp strains

2.4 23S r RNA基因测序结果分析以标准菌株Hp 26695的23S rRNA基因序列作为参考标准，采用DNAMAN软件将所有Hp菌株核苷酸序列与其比对（图7）。28株克拉霉素耐药菌株均发生突变，最常见的突变位点为A 2143G，突变率为85.7%（24/28）；A 2223G突变率为10.7%（3/28）；1株菌株发生A 2142G+A 2164G双位点联合突变（3.6%），而所有敏感菌株均未发生突变。见表3。

图7 部分Hp菌株23S r RNA基因核苷酸序列比对Fig.7 Nucleotide sequence comparison of 23S r RNA gene of some Hp strains

表3 克拉霉素耐药基因23S r RNA突变位点分析Tab.3 Analysis on 23S rRNA mutation of clarithromycin resistance gene

2.5 rdx A基因测序结果分析以标准菌株Hp 26695的rdxA基因序列作为参考标准，采用DNAMAN软件将Hp菌株核苷酸序列与其比对，ClustalX 2.0软件比对其氨基酸序列。结果发现22株测序甲硝唑耐药菌株均发生突变，突变位点分布随机且散在。其中，错义突变为主要的突变形式，占77.3%（17/22）；核苷酸插入或缺失发生移码突变导致蛋白翻译提前终止占18.2%（4/22）；13.6%（3/22）出现无义突变导致过早终止密码子。见表4。

表4 甲硝唑耐药基因rdxA核苷酸和氨基酸突变位点分析Tab.4 Analysis on nucleotide and amino acid mutations in metronidazole resistance gene rdxA

2.6 gyr A基因测序结果分析以标准菌株Hp 26695的gyrA基因序列作为参考标准，采用DNAMAN软件比对所有菌株氨基酸序列（图8）。35株左氧氟沙星耐药菌株中，N87K突变率为65.7%（23/35）；D91N突变率为8.5%（3/35）；各有1株Hp分别发生N87I、D91G和N 87K+D143E双位点联合突变，突变率为2.9%（1/35）；另有6个耐药菌株（17.1%，6/35）gyrA基因未发生任何位点突变。见表5。

表5 左氧氟沙星耐药基因gyr A突变位点分析Tab.5 Analysis on gyrA mutation in levofloxacin resistance gene

图8 部分Hp菌株gyr A基因氨基酸序列比对Fig.8 Amino acid sequence comparison of gyr A gene of some Hp strains

3 讨 论

Hp可在胃内低pH环境下长时间存活，对胃黏膜具有破坏作用，是唯一可以在胃内定殖的病原体［10］。研究［11-12］显示：世界上约有一半人口感染了该病原体，然而不同地区的感染率不同，其中发展中国家的感染率高于发达国家，我国的Hp感染率为40%～70%。既往临床上根除Hp的首选方法是质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）联用两种抗生素组成的三联疗法，但是由于抗生素的不规范使用，Hp的耐药率逐年上升，标准三联疗法治疗Hp的根除率明显降低［13-14］。第五次全国Hp

感染处理共识报告推荐“铋剂+质子泵抑制剂+2种抗菌药物”组成的四联疗法为一线根除治疗方案［15］。在我国，Hp对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星等抗生素的耐药率呈上升趋势，并且具有多重耐药性，但Hp对四环素和阿莫西林的耐药率较低，在治疗方案中应合理选择抗生素［16］。因此，阐明和鉴定Hp耐药的分子机制，对于开发新的抗生素，设计合理的抗生素组合，提高临床治疗成功率具有重要意义。

Hp对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星耐药主要是由于耐药基因突变导致。23S rRNA基因Ⅴ区上点突变是导致Hp对克拉霉素耐药的主要原因，主要突变位点有A 2143G、A 2142G和A 2142C［17］。此外还发现了新的突变位点包括A 2144G［18］、T 2182C［19］、T 2183C［20］、A 2116G、A 2181G［21］、A 2115G和G2111A［22］等，但其突变频率较低。本研究结果表明：A 2143G位点突变率占85.7%（24/28），为主要的突变方式；其他突变方式为A 2223G，占10.7%（3/28）；A 2142G和A 2164G位点联合突变占3.6%（1/28）。rdxA基因突变是引起甲硝唑耐药的主要机制，但是其突变位点分布散在，缺乏规律［23］。有研究［24］显示：甲硝唑耐药株的rdx A基因大部分存在错义突变占32.4%（12/37），无义突变占32.4%（12/37），18.9%（7/37）rdxA等位基因存在核苷酸缺失或插入，导致翻译移码。本研究结果显示：错义突变是最常见的突变，占77.3%（17/22），移码突变和无义突变分别占18.2%（4/22）和13.6%（3/22）。Hp对氟喹诺酮类药物耐药机制已被发现与gyrA基因的喹诺酮类耐药决定区（QRDR）突变有关，氨基酸替换主要发生在第87和91位［25-27］。本研究结果显示：gyrA最常见的氨基酸突变方式为N87K，占65.7%（23/35），其他突变方式有D91N（8.5%，3/35）、N87I（2.9%，1/35）和D91G（2.9%，1/35）和N87K+D143E（2.9%，1/35），此外有6株耐药菌未检测到突变，提示可能存在其他耐药机制，例如外排系统、生物膜或新的耐药基因突变［28］。

本研究检测了Hp对3种常见抗生素耐药相关基因突变位点，与以往研究比较，既有相同点，又有新发现的突变点，本研究结论为进一步探讨耐药机制提供了依据，同时为新药的研发提供了方向。