构建电化学适配体生物传感检测薏苡仁和白扁豆中赭曲霉毒素A的研究

毛伟伟，胡奕津，黄丽珊，范 申，张红艳

（福建中医药大学药学院，福建福州 350122）

近年来，真菌毒素对中药的污染屡见报道，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）因分布广泛备受关注［1-2］。人们服用受毒素污染的中药材或饮片摄入OTA，导致其在体内蓄积，引发肝肾毒性、致癌性和致畸性等严重毒性作用［3］。常规的中药炮制加工并不能完全去除OTA，而受OTA 污染的中药材脱毒过程繁琐且昂贵，可能造成活性成分丧失。因此，尽早检出中药材或饮片中可能存在的OTA污染，能够及时对受污染的中药进行处置，是保障中药质量和用药安全的一种经济有效的方法。

以核酸适配体（aptamer，Apt）为识别元件的电化学生物传感器结合了适配体高特异性、高亲和力与电化学方法简单便携、响应快、成本低、灵敏度高等优点，在高灵敏检测OTA 方面具有广阔的应用前景［4］。材料科学的发展为高灵敏传感策略的构建提供了更多选择。纳米金（NG）具有优良的生物相容性和导电性能，被广泛用作电极修饰材料来提高电化学传感性能［5］。还原氧化石墨烯（rGO）是一种创新的碳基材料，具有比表面积大、生物相容性好、稳定性好、电催化活性高和导电性好等优点［6］。与化学还原制备的rGO 相比，电化学还原氧化石墨烯（ErGO）具有均匀稳定、经济环保、简单快速和易于控制等优点［7］。研究表明，单链DNA（ssDNA）的碱基能够与rGO 表面丰富的芳香环结构产生π-π堆叠作用而被吸附到rGO 表面［8］。该特性被广泛用于构建荧光和电化学适配体传感方法，对目标物进行快速定量检测［9-10］。

基于上述研究基础，本研究通过一步电沉积法制备ErGO-NG 涂层修饰的玻碳电极，吸附亚甲基蓝（MB）标记的OTA 特异性单链核酸适配体，构建高灵敏、快速检测OTA 的新方法，并将其应用于中药样品中OTA 的检测，以期为中药材OTA 污染现场快速检测提供新思路。

1 实验材料

1.1 实验仪器 CHI660E 电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；CHB-202恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）；BSA224S 电子分析天平（德国Sartorius公司）；5810R 台式离心机、minispin plus 高速离心机（德国Eppendorf 公司）；ALPHA 1-2LD PLUS 冻干机（德国Marin Christ 公司）；SHP-250 生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；KQ-116 超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FE28 型pH 计（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q Integra 超纯水机（法国Merckmillipore 公司）。

1.2 实验试剂与药物 氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；石墨粉（上海麦克林生化科技有限公司）；四氯金酸三水合物（上海阿拉丁生化科技有限公司）；玻碳电极（武汉高仕睿联科技有限公司）；银/氯化银参比电极和铂丝对电极（上海辰华仪器有限公司）；OTA、黄曲霉毒素B1（AFB1）、呕吐毒素（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）标准品（纯度＞99%）（北京坛墨质检科技有限公司）；本实验中所有试剂均为分析纯级别；所有水溶液均使用Millipore Milli-Q 系统纯化的超纯水（18.2 MΩ·cm）配制；中药饮片薏苡仁和白扁豆均购自福州本地药店；本实验所用3'端标记有MB 的OTA 适配体（Apt-MB）序列为：5'-GATCGGGTCTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-MB-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并纯化。

2 实验方法

2.1 氧化石墨烯（GO）的合成与表征 将0.5 g 石墨粉、0.5 g 硝酸钠和23 mL 的浓硫酸置于圆底烧瓶中，于冰水浴中搅拌混匀，加入3 g KMnO4粉末，于35 ℃下持续搅拌约1 h，直到圆底烧瓶中形成浓稠的糊状物。接着加入40 mL 超纯水，同时迅速将温度提高至90 ℃，继续搅拌30 min。最后加入100 mL超纯水与3 mL 的30%过氧化氢溶液，当混合液的颜色由深棕色变为黄色表示反应终止。将混合液趁热过滤，将滤饼搅拌分散在超纯水中，随后将滤饼分散液分装在50 mL 的离心管中，1 000 r/min 低转速离心3 min，多次重复操作直至完全去除大颗粒沉淀物。取上清液在8 000 r/min 下离心15 min，取沉淀物GO 重悬到超纯水中，并用超声处理以促进GO 的分散。将上述制备的GO 分散液进行冷冻干燥，最终得到干燥蓬松的黄色GO 粉末。将合成的GO 分散在水中，采用透射电子显微镜对其形貌进行表征。

2.2 工作电极的制备 将玻碳电极（GCE）打磨抛光至光滑镜面并对GCE 进行活化，将活化后的GCE、银/氯化银参比电极和铂丝对电极构成的三电极体系浸入含有0.5 mg/mL GO 和2.5 mmol/L 氯金酸的混合溶液中，采用循环伏安法（CV）在+0.6～-1.6 V 电位范围内电沉积5 圈制备ErGO 和NG涂层修饰的GCE（ErGO-NG/GCE），用超纯水清洗后干燥备用。

2.3 传感器的构建及OTA 的电化学检测 将“2.2”项下制备的ErGO-NG/GCE 浸泡在含1 μmol/L Apt-MB 的PBS 缓冲液（10 mmol/L，pH 7.4）中孵育2 h，孵育后PBS 缓冲液清洗，低流速氮气干燥即完成传感器的构建。将20 μL 不同浓度的OTA 标准品溶液滴加在电极表面，于20 ℃下反应1 h，用PBS 缓冲液冲洗后将电极体系置于PBS 缓冲液中进行差分脉冲伏安法（DPV）检测。

2.4 方法的条件优化 为使所建立的传感方法具有最佳表现，在OTA 浓度为10 ng/mL 条件下，以达到最大峰电流差值ΔIp（ΔIp＝I－I0，其中I 和I0分别表示待测物加入后与前的峰电流值）为判断依据，依次对Apt-MB 的浓度（0.5、0.8、1、1.5、2 μmol/L）、OTA 与Apt-MB 的反应温度（10～35 ℃）、反应缓冲液的pH（6.0～8.5）和反应时间（15～120 min）分别进行了优化。

2.5 方法的选择性考察 在最优的实验条件下，将构建好的传感器分别与空白PBS 缓冲液、5 ng/mL OTA 标准品溶液、50 ng/mL 的其他真菌毒素（AFB1、ZEN 和DON）标准品溶液以及上述毒素混合物溶液（含5 ng/mL OTA 和50 ng/mL 的其他真菌毒素）孵育并用PBS 缓冲液冲洗后，将电极体系置于PBS 缓冲液中进行DPV 检测，每组平行测定3 次。

2.6 方法的重复性与再现性考察 在最优的实验条件下，使用同一批次的GCE 按照“2.2”“2.3”项构建传感器，与5 ng/mL 的OTA 孵育后采用DPV 平行测定6 次，并记录峰电流变化考察方法的重复性；使用不同批次的GCE 同样按照“2.2”“2.3”项构建传感器，与5 ng/mL 的OTA 孵育后采用DPV 平行测定6次，并记录峰电流变化考察方法的再现性。

2.7 中药样品加标回收率测定 分别将中药饮片薏苡仁和白扁豆打粉过筛，称取1.0 g 药材细粉于50 mL 离心管中，加入适量OTA 标准溶液，混匀后加入10 mL 甲醇-水（7∶3）超声提取30 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm 微孔滤膜后取续滤液，用PBS 缓冲液稀释定容，制成低、中、高（0.1、1.0、10.0 ng/mL）3 种浓度的OTA 样品溶液进行加标回收率测定，每种浓度平行测定3 次。

3 结 果

3.1 GO 与ErGO-NG/GCE 的形貌表征 从图1A的透射电镜图可以看出本实验所合成的GO 在溶液中能够被剥离分散成单片薄层，并呈现出卷曲、褶皱和边缘折叠的GO 典型形貌特征，证明了GO 的成功制备；从图1B 的扫描电镜图可以观察到GCE电极表面电沉积的ErGO 具有更多的褶皱结构，并且NG 能够分散在ErGO 涂层中，表明一步电沉积法成功制备了ErGO-NG/GCE。

图1 GO 与ErGO-NG/GCE 的形貌表征图

3.2 传感平台构建的电化学表征 在-0.2～+0.6 V电位范围内，采用CV 法以50 mV/s 的扫描速率在含0.1 mol/L KCl 和5.0 mmol/L［Fe（CN）6］4-/3-的PBS缓冲液中对不同修饰阶段的电极进行表征。如图2 所示，裸GCE 具有一对大小相近的氧化还原峰（曲线a），当在GCE 表面电沉积ErGO-NG 后，可以看到氧化还原峰电流均增大（曲线b），这是由于导电性良好的ErGO 和NG 改善了电极表面的电导率；当Apt-MB 修饰到ErGO-NG/GCE 表面后，观察到曲线c 的氧化还原峰电流大幅下降，并且峰间电位差增大，这是由于Apt-MB 的磷酸骨架带负电荷，对同样带负电的电子具有排斥作用，此外大量Apt-MB 的吸附也增大了电极表面的空间位阻，最终导致电极表面电导率下降。上述结果表明各组分在GCE 表面的组装是成功的，间接证明了所构建的传感平台的可行性。

图2 不同修饰电极的CV 图

3.3 Apt-MB 浓度的优化 从图3 可以看出，ΔIp随着Apt-MB 的浓度增大而增大，当Apt-MB 浓度为1 μmol/L 时产生的ΔIp达到平台值，即使继续增大Apt-MB 浓度也没有明显增大，因此选择1 μmol/L的Apt-MB 进行后续实验。

图3 不同浓度Apt-MB 对峰电流差值的影响

3.4 OTA 反应条件的优化 从图4A 可以看出，随着反应温度的增大，ΔIp呈现先增大后减小的趋势，因此选择20 ℃作为最优反应温度；从图4B 可以看出，当反应缓冲液的pH 值为7.4 时，ΔIp达到最大值，因此选择pH 7.4 的缓冲液进行后续实验；从图4C 可以看出，ΔIp随着反应时间的增加而增大，并在反应60 min 时达到平台值，因此选择60 min 作为后续OTA 与Apt-MB 的反应时间。

图4 OTA 与Apt-MB 的不同反应条件对峰电流差值的影响

3.5 标准曲线的建立 在最优的实验条件下对不同浓度的OTA 进行DPV 检测，结果如图5A 所示。在0～10 ng/mL 范围内，随着OTA 浓度的增加，吸附在电极表面的Apt-MB 不断与OTA 结合并脱离电极表面，导致MB 信号电流不断减小。研究发现，在0.05～10 ng/mL 范围内，峰电流值Ip与OTA 浓度的对数（logCOTA）之间具有良好的线性关系，如图5B所示，线性方程为：Ip＝1.446 9logCOTA－11.338 1，相关系数r＝0.993 8，检测限（3 σ/S）为0.03 ng/mL。

3.6 方法的选择性考察 在最优条件下，用本方法分别 对5 ng/mL 的OTA 和50 ng/mL 的AFB1、ZEN和DON 进行检测。从图6 可以看出，尽管非目标毒素的浓度为OTA 的10 倍，但它们产生的ΔIp值都很小，而5 ng/mL 的OTA 则能够产生明显增大的ΔIp值。此外，毒素混合物溶液也会使ΔIp值明显增大，并且产生的ΔIp值与单独OTA 的ΔIp值基本一致，上述结果表明本方法对OTA 具有较强的选择性，即本传感器能够有效对抗其他毒素成分对OTA 检测的干扰。

图5 OTA 标准曲线的建立

图6 方法的选择性考察

3.7 方法的重复性和再现性考察 在最优条件下，分别使用同批次和不同批次的GCE 电极构建传感器对5 ng/mL 的OTA 平行测定6 次，并记录峰电流变化。实验结果表明，6 次重复性测定和再现性测定结果的相对标准偏差（RSD）分别为2.11%和3.64%，表明本方法具有良好的重复性和再现性。

3.8 中药实际样品加标回收率测定 选择2020 年版《中华人民共和国药典》中规定OTA 检测的中药薏苡仁和白扁豆进行加标回收测试。在经HPLC及本方法皆未检出OTA 的薏苡仁和白扁豆样品中分别添加0.1、1、10 ng/mL 的OTA 标准品，加标样品采用本方法进行测定，结果如表1所示，本方法对2种中药饮片样品的加标回收率为92.94%～105.17%，RSD≤5.60%，说明该方法回收率和稳定性良好，具有快速检测中药材OTA 污染的应用前景。

4 讨 论

目前常用的OTA 检测方法包括基于色谱的检测法（如高效液相色谱及其与质谱的联用法等）和免疫分析法（如酶联免疫测定法和胶体金免疫层析法等）。前者灵敏度高、结果精确，但需要大型且昂贵的仪器与专业的检测人员，无法满足中药材OTA现场快速检测的需求；后者快速高效、特异性强，但抗体存在制备过程复杂、稳定性差、具有批次间差异等缺陷，限制了其广泛应用［11］。

表1 薏苡仁与白扁豆样品中OTA 的加标回收率测定（n＝3）

本研究基于ErGO-NG 材料和OTA 特异性适配体构建了一种电化学传感检测方法用于OTA 的高灵敏检测，见图7。Apt-MB 通过π-π 堆叠作用吸附在ErGO-NG/GCE 表面，当体系中不存在OTA时，电极表面吸附的MB 分子在一定电位下可产生较大的峰电流；当体系中存在OTA 时，OTA 可与Apt-MB 结合形成稳定复合物，使Apt-MB 的结构发生卷曲，削弱了适配体与电极表面的π-π 堆叠作用，导致部分Apt-MB 远离电极表面，使吸附在电极表面的MB 减少，相应的峰电流发生改变。据此可通过测量峰电流的变化实现对OTA 的定量检测。

图7 OTA 电化学传感检测的原理图

在最优条件下，本方法的线性范围为0.05～10 ng/mL，检测限为0.03 ng/mL。这应该归功于通过一步电沉积法修饰在电极表面的ErGO-NG 材料具有良好的生物相容性和导电性能，提高了电极的导电能力，进而大大提高了方法的灵敏度。将本方法应用于中药实际样品薏苡仁和白扁豆中OTA 的测定，加标回收率为92.94%～105.17%，RSD≤5.60%。该方法具有制作简单、操作方便、响应速度快、检测效率高、成本低廉和灵敏度高等优点。此外，本方法的选择性强，即使在其他高浓度真菌毒素共存的情况下，也能实现对OTA 检测，具有中药材OTA 污染现场快速检测的应用前景。

本方法具有潜在的通用性，可将识别元件更换为其他真菌毒素的适配体，可能实现对其他真菌毒素的快速检测，有望为中药材中真菌毒素的现场快速检测提供一种经济便利、高效灵敏的新思路。