蒲葵子乙醇提取物调控p21/CDK1/CyclinB1诱导肝癌细胞G2/M期阻滞的机制研究

林 薇，陈旭征，曹治云，郑良朴，章尤权，赵锦燕*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州 350122；3.福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州 350003）

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织统计，全世界每年约有84 万例新发患者，癌症致死率居全球第二，严重威胁人民健康和生命［1］。目前，作为常规治疗方法的放化疗毒副作用大，影响患者的生活质量。因此，低毒、有效的天然抗肿瘤药物成为了肿瘤治疗的研究热点。蒲葵子是棕榈科蒲葵的种子，具有凉血止血、止痛和抗癌的作用，研究发现蒲葵子对肝损伤具有保护作用［2］。目前，国内外已有关于蒲葵子抗肝癌活性成分的研究及抗肿瘤作用的报道［3-4］，课题组前期实验发现，蒲葵子乙醇提取物（ethanol extract of Livistona chinensis seeds，EELC）能够通过促进线粒体凋亡途径抑制肝癌生长（EELC 抑制约50%瘤体积和减少43%肿瘤重量）［5］，但蒲葵子抑制肝癌细胞增殖的机制研究尚未见报道。因此，本实验拟以人肝癌HepG2 细胞和裸鼠皮下移植瘤为研究对象，研究EELC 抑制肝癌细胞增殖的作用和分子机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞和动物 人肝癌HepG2 细胞购自中国科学院上海细胞库。20 只4～6 周龄雄性BALB/c裸鼠，体质量18～20 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2014-0005，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF 级实验室。饲养实验室内温度与湿度恒定，每天给予光照12 h，正常饮用水及饮食。

1.2 实验试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清、青-链霉素、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；MTT 粉末（北京索莱宝科技有限公司）；细胞周期试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）；细胞周期蛋白B1（CyclinB1）、周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21（p21）、增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.3 实验仪器 旋转蒸发仪（瑞士Flawil 公司）；酶标仪（瑞士TECAN 公司）；流式细胞仪（美国BD 公司）；石蜡切片机（德国Leica 公司）；生物组织自动脱水机和生物组织石蜡包埋机（湖北孝感医用电子技术有限公司）；形态学显微图像分析系统（美国Media Cybernetics 公司）。

2 实验方法

2.1 EELC 的制备 参照文献［5］制备方法，500 g蒲葵子加入5 000 mL 85%乙醇（体积比1∶10）回流提取后过滤，将滤液浓缩到相对浓度1.05 后喷雾干燥得到EELC 粉末，用HPLC-TOF/MS 进行成分分析。EELC 粉末以DMSO 配置为500 mg/mL 储存液用于细胞实验，用时稀释（DMSO 终浓度不超过0.5%）；以生理盐水配置为300 mg/mL 灌胃液用于动物实验。

2.2 细胞分组 将HepG2 细胞分为0、0.125、0.25、0.5 mg/mL 组，分别给予0、0.125、0.25、0.5 mg/mL浓度EELC 干预24 h。

2.3 MTT 法检测细胞活力 将处于对数生长期的HepG2 细胞以1×105个/mL 的浓度接种于96 孔板中，每孔100 μL。细胞贴壁过夜后，按“2.2”项下分组干预24 h 后，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT 溶液孵育4 h，吸弃上清液，加入100 μL DMSO 溶解，充分震荡后于酶标仪570 nm 处检测吸光度（A）值，并计算细胞活力（对照组100%）。

2.4 平板克隆形成实验 按“2.2”项下分组干预24 h的HepG2细胞，以1 000个/孔的密度接种于6孔板中，培养7 d 后，多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，计算克隆形成率（空白组100%）。

2.5 流式细胞术检测细胞周期 按“2.2”项下分组干预24 h 的HepG2 细胞，制备成单细胞悬液，冰乙醇固定过夜后，按照试剂盒说明书用PI 染色后加入RNA 酶抑制剂，于流式细胞仪FL2 通道获取10 000 个细胞，采用ModFit 软件分析细胞G0/G1、S、G2/M 期的百分比。

2.6 皮下移植瘤模型建立及给药 将处于对数生长期的HepG2 细胞和基质胶以1∶1 比例混合均匀，以2×106个/mL 接种于裸鼠右腋皮下，待瘤体长至100～150 mm3，将裸鼠随机分为对照组和EELC 组，每组10 只。EELC 组按3 g/（kg·d）予EELC 灌胃液灌胃，对照组以等体积生理盐水灌胃，每日1 次，每周5 d，连续灌胃3 周。取材前8 h 禁食不禁水，戊巴比妥钠麻醉后，颈椎脱臼处死，剥离肿瘤组织，取约1 cm3固定于4%多聚甲醛待测。

2.7 免疫组织化学法检测小鼠肿瘤组织PCNA、CDK1、CyclinB1、p21 的蛋白表达 肿瘤组织包埋切片后，脱蜡进行抗原修复，加入100 μL 内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min，加入100 μL 非特异染色阻断剂，室温封闭30 min，滴加100 μL PCNA、Cyclin B1、CDK1、p21 一抗工作液（1：200），4 ℃孵育过夜，滴加100 μL 生物素标记的羊抗小鼠/兔IgG，室温孵育30 min，滴加适量的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶室温孵育10 min，滴加100 μL 新鲜配制的DAB 显色液，光镜观察下控制显色，显色到棕黄色后置于蒸馏水中漂洗，终止显色，苏木素溶液中染色30 s，至细胞核呈浅蓝色后，PBS 缓冲液返蓝10 min，中性树脂封片，光学显微镜随机拍取5 个视野，运用Motic 6.0 图像分析系统对阳性率进行半定量分析［6］。

2.8 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行分析。计量资料符合正态分布以（xˉ±s）表示，2 组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析；不符合正态采用非参数检验。

3 结 果

3.1 4 组HepG2 细胞活力比较 如图1 所示，不同浓度（0.125、0.25、0.5 mg/mL）EELC 均可以显著抑制HepG2 细胞活力（P＜0.05），呈剂量依赖。

图1 4 组HepG2 细胞活力比较

3.2 4 组HepG2 细胞克隆形成情况比较 平板克隆形成实验显示，与0 mg/mL 组比较，不同浓度（0.125，0.25，0.5 mg/mL）EELC 均可 以显 著抑 制HepG2 细胞克隆形成率（P＜0.05），呈剂量依赖，见图2。

图2 4 组HepG2 细胞克隆形成情况比较

3.3 4组HepG2细胞周期情况比较 如图3所示，与0 mg/mL 组比较，不同浓度（0.125、0.25、0.5 mg/mL）EELC 均可以明显抑制细胞周期进程（P＜0.05），使其阻滞于G2/M 期，进而抑制细胞分裂增殖。

3.4 2 组小鼠肿瘤组织PCNA 表达 如图4 所示，与对照组比较，EELC 组明显抑制小鼠肝癌组织PCNA 表达（P＜0.05）。

图3 4 组HepG2 细胞周期情况比较

图4 2 组小鼠肿瘤组织PCNA 表达（×400）

3.5 2 组 小 鼠 肿 瘤 组 织CDK1、CyclinB1 和p21 表达 如图5 所示，与对照组比较，EELC 组明显抑制小鼠肝癌组织CDK1 和CyclinB1 表达（P＜0.05），促进p21 表达（P＜0.05）。

图5 2 组小鼠肿瘤组织CDK1、CyclinB1 和p21 表达（×400）

4 讨 论

肝癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，根据其临床表现，一般将肝癌归属于中医学“积聚”“癥瘕”“臌胀”“胁痛”等范畴。肝癌是病因病机极其复杂的全身性疾病，由于人体正气亏虚，气血阴阳失调，脏腑功能紊乱，机体产生的瘀血、痰浊、热毒等病理产物相互搏结，蕴结于内，迁延日久，积而成块［7］。蒲葵子是棕榈科植物蒲葵的种子，味苦、性寒，具有活血化瘀、软坚散结的功效，临床可用于肝癌等多种癌症治疗［2］。

细胞周期调节失控导致细胞异常增殖是恶性肿瘤发生的重要机制，本研究发现EELC 可以抑制肝癌HepG2 细胞的生长，阻滞细胞周期，抑制细胞增殖。为探讨其可能作用机制，本研究构建了裸鼠皮下移植瘤模型，检测了调控细胞周期的相关蛋白的表达情况。PCNA 是DNA 聚合酶δ 的辅助因子，在DNA 复制中发挥重要作用，是评价细胞增殖状态的重要指标，在肿瘤细胞中，PCNA 呈现过表达状态［8］。本研究通过免疫组化检测组织细胞中PCNA 蛋白水平发现，EELC 可下调PCNA 蛋白表达，提示EELC 可能通过抑制组织细胞中PCNA 表达来发挥抑制细胞增殖的作用。

细胞周期主要通过细胞周期蛋白、蛋白依赖激酶以及激酶抑制剂共同调控，细胞周期蛋白和蛋白激酶的异常表达会导致周期调控失常。细胞周期蛋白分为G1期、S期和M 期，CyclinB1是M 期周期蛋白，从S 期开始表达，在G2/M 期到达峰值，后期消失。CDK1 的活化依赖于CyclinB1，CyclinB1 与CDK1 结合，激活CDK1 可以促进细胞由G2 期进入M 期［9］。本研究发现，EELC 干预会使细胞周期阻滞在G2/M 期，因此进一步检测EELC 对CyclinB1和CDK1 表达的影响。结果显示，EELC 明显抑制了CyclinB1 和CDK1 的表达，说明EELC 调控G2/M期蛋白阻断周期进程，抑制肝癌细胞增殖。

p21 是细胞周期蛋白激酶抑制剂，能够抑制CDK1/CyclinB1 的结合活化，阻滞细胞G2/M 期转变［10］；p21 还可以和PCNA 的δ 亚基结合，抑制细胞增殖［11］。结果显示，EELC 可以促进p21 表达，证实EELC 促进p21表达，阻断细胞G2/M 进程，抑制细胞增殖。

综上所述，EELC 能够明显抑制肝癌HepG2 细胞以及皮下移植瘤的生长，对肝癌HepG2 的增殖具有抑制作用，其发挥抑制作用的机制可能是通过促进p21 的表达，抑制PCNA、CDK1 和CyclinB1 的表达，阻断细胞周期进程来实现的，研究结果将为EELC 在肝癌的临床应用提供有力的证据。目前研究发现，蒲葵子的有效化学成分包括黄酮类、酚类、皂苷类等，作为民间常用的治疗肝癌的药物，我们后期实验将进一步研究蒲葵子主要化学类成分的抗肿瘤活性，为临床筛选低毒、高效的抗癌保肝药物提供理论依据。