基于整合药理学的安子调冲方改善复发性流产合并抗磷脂综合征的分子机制研究

何 珊，宁 艳，马 飞，蒋绍艳，刘大艳，王智玮，吴芳婷

（南方医科大学附属深圳市妇幼保健院，广东深圳 518028）

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指与同一性伴侣，在妊娠前20 周，连续发生3 次及以上自然流产，其发生率约占育龄期女性的1%～5%［1］。生殖免疫、内分泌、感染、遗传、解剖及环境等被认为是RSA 的诱发因素。然而，RSA 的临床诊治具有一定的难度，因其有病因复杂、特异性临床表现和诊断标准缺乏等的特点，且治疗手段尚存争议［2］。近年来，一种自身免疫疾病，由抗磷脂抗体与自身磷脂抗原相互作用引发的抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome，APS）所致RSA 在临床中的发病率逐年提升［3］，可出现动静脉血栓形成、动脉粥样硬化、胎停等一系列症状［4-5］。APS 约占RSA 病因的20%。患者多因RSA 就医时首次发现APS。目前认为APS 导致RSA 的过程是血管内皮和胎盘滋养层细胞表面的磷脂与抗磷脂抗体结合，促进炎症因子释放，破坏内皮细胞，影响胚胎滋养层细胞的迁徙和浸润，同时来源于血小板的表面受体与抗原抗体复合物结合后导致血小板聚集黏附增多，促进发生磷脂依赖的凝血［6］，共同引起胎盘内的动静脉血栓，干扰胎盘功能，最终发生妊娠不良事件［7］。

RSA/APS 常用低分子肝素、阿司匹林治疗，虽具有一定疗效，但不良反应较多，导致患者精神心理负担加重甚至拒绝使用西药，从而倾向于毒性低、较少不良反应、安全稳定的中药保胎疗法。安子调冲方（ATF）为深圳市妇幼保健院近10 年在临床治疗复发性流产中取得较好疗效的经验方，由菟丝子、桑寄生、续断、蒲黄炭、鸡血藤、人参和陈皮组成。方中以补肾活血为法，以寿胎丸去阿胶加健脾行气活血之品而成。本研究借助中医药整合药理学研究平台V2.0（TCMIP V2.0），从分子水平建立ATF 治疗RSA/APS 的多成分、多靶点及多通路作用网络，诠释ATF 治疗RSA/APS 的可能作用机制，以期为该复方的临床应用提供依据。

1 方 法

1.1 ATF 化学成分来源 基于TCMIP V2.0（http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）［8］的“中药材数据库”，收集菟丝子、桑寄生、续断、蒲黄炭、鸡血藤、人参、陈皮所含化学成分（TCMIP V2.0 的“中药材数据库”没有收录蒲黄炭的化学成分和相关靶标信息，本文使用的是蒲黄的相关数据），构建ATF化学成分数据库。

1.2 RSA/APS 靶标收集 在TCMIP V2.0“疾病相关分子库”中输入关键词“antiphospholipid syndrome”及“recurrent spontaneous abortion”，并通过GeneCards（http：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//omim.org/）完善相关的疾病靶标，去重后建立RSA/APS靶标数据库。

1.3 ATF 治疗RSA/APS 的潜在靶标 利用Venny 2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分析活性成分和RSA/APS 靶点，得到ATF 治疗RSA/APS 的潜在靶标。

1.4 潜在靶标相互作用（PPI）网络构建 为了阐明潜在靶标在系统水平上的相互作用关系，将“1.3”项得到的靶标上传到STRING 11.0（https：//string-db.org/）［9］，设置“homo sapines”的Organism，minimum required interaction score 的confidence 为0.4，把孤立靶蛋白清除，收集蛋白互作信息，并导入Cytoscape 3.7.2 软件构建网络并进行拓扑学分析，对度值（degree，D），介数（betweenness，B）、接近中心性（closeness，C）和特征向量中心性（eigenvector，E）进行分析，分析大于D 值中位数的靶标，进一步计算B、C和E，核心靶标需同时满足D、B、C 和E 拓扑结构特征值均大于中位数。

1.5 ATF 治疗RSA/APS 潜在靶标的通路和功能分析及网络构建 潜在靶标利用DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，构建ATF 治疗RSA/APS 的多维网络。

1.6 吸收水平分析 在“1.5”项下构建的多维网络中，来源于多种中药的成分为核心成分，检索TCMIP V2.0 的“中药成分数据库”，获取吸收、分配、代谢、排泄和毒性（ADMET）吸收水平（ADMET Absorption Level），数值含义依次为：“Good”用0 表示，“Moderate”用1 表示，“Low”用2 表示，“Very low”用3 表示。结合ADMET 中的重要药动学参数口服生物利用度（OB）以及类药性（DL）对核心化学成分进行分析。

2 结 果

2.1 ATF 化学成分及其靶标预测 共获得ATF 中化学成分256 个，预测靶标847 个。菟丝子8 种成分，81 个靶标；桑寄生6 种成分，139 个靶标；续断1种成分，21个靶标；蒲黄24种成分，242个靶标；鸡血藤20 种成分，54 个靶标；人 参157 种成分，823 个靶标；陈皮48 种成分，80 个靶标。其中有8 种成分重复。

2.2 ATF 治疗RSA/APS 的潜在靶标及其相互作用 共得到500 个RSA/APS 的靶标。将ATF 靶标与RSA/APS 靶标进行匹配，得到45 个ATF 治疗RSA/APS 的潜在靶标。将潜在靶标在STRING 平台构建PPI 网络，见图1，并把网络导入Cytoscape 3.7.2 软件进行网络拓扑学分析，满足“1.4”项下筛选条件的16 个靶标为可能的核心靶标，分别是白介素-6（IL-6，D＝29）、肿瘤坏死因子（TNF，D＝23）、SRC 原癌基因/非受体酪氨酸激酶（SRC，D＝21）、雌激素受体α（ESR1，D＝20）、环加氧酶2（PTGS2，D＝18）、白介素-1β（IL-1B，D＝17）、Toll 样受体4（TLR4，D＝17）、细胞色素P450家族19A1（CYP19A1，D＝15）。

图1 ATF 治疗RSA/APS 潜在靶标相互作用网络图

2.3 ATF 治疗RSA/APS 潜在靶标的通路和功能分析 潜在靶标主要富集于核因子-κB 进入细胞核的正调节（positive regulation of NF-κB import into nucleus）、炎症应答（inflammatory response）、生成白介素-6 的正调节（positive regulation of interleukin-6 production）和趋化因子产生的正调控（positive regulation of chemokine production）等与RSA/APS 发生相关的功能；主要富集于KEGG 的关键通路有核因子-κB 信号通路（NF-κB signaling pathway）和Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）等，见图2、图3。

2.4 ATF 治疗RSA/APS 的多维网络 应用“2.3”项中的关键GO 功能及KEGG 通路构建“中药复方-成分-潜在靶标-关键功能及通路”的多维网络，见图4。结果涉及ATF 的98 种成分及23 个靶标。菟丝子5 种，续断1 种，桑寄生6 种，蒲黄15 种，鸡血藤1 种，人参74 种，陈皮1 种。其中槲皮素为菟丝子、桑寄生和蒲黄共有成分，山奈酚为菟丝子和人参的共有成分，棕榈酸来自人参和蒲黄，β-谷甾醇为蒲黄、人参和陈皮的共有成分。这些成分通过联合调节TNF、IL-6、IL-1B 等靶标参与氧化还原过程、炎症应答等功能及Toll样受体和核因子κB等信号通路。

2.5 ATF 核心成分的吸收水平分析 在“2.4”项下所构建的多维网络中来源于多种中药组分的4 种成分为核心成分，并进行ADMET 吸收水平分析，见表1。结果发现槲皮素和山奈酚吸收水平较好。

图2 ATF 治疗RSA/APS 潜在靶标GO 功能

图3 ATF 治疗RSA/APS 潜在靶标KEGG 通路富集分析

图4 ATF 治疗RSA/APS 的多维网络

3 讨 论

RSA/APS 由于内皮细胞被抗磷脂抗体破坏，再加上抗原抗体复合物引起的血小板黏附增多，导致血栓在微循环内形成。同时滋养细胞也可被抗磷脂抗体破坏，继而导致妊娠不良事件的发生。本研究团队为岭南罗氏妇科工作分站点，团队骨干成员师承罗颂平教授，经过多年对名医学术思想和临证经验的继承、整理和发扬，发现RSA/APS 的病机为肾虚、胎元不固，合并血瘀证［10］。所以临床以补肾活血为治则，以寿胎丸为基础方，去阿胶加行气活血之品而成的安子调冲方，方中君药菟丝子，补肾安子，益精固冲；臣药续断和桑寄生，共起补肝肾、调冲任的作用，使胎气强壮；佐以蒲黄炭、鸡血藤以活血化瘀，人参、陈皮为使，健脾、补气、行气以助活血之效，七药共奏补肾安胎、活血调冲之功。此方已在我院临床使用近10年，并有较好改善RSA/APS 的临床疗效，但是其作用机制并未阐明。本文应用大数据的手段，通过整合药理学的策略［11］，充分利用国内外专业数据平台及相关分析软件，搜集ATF 治疗RSA/APS 的潜在作用靶标，并对其进行分析，构建了“中药复方-成分-潜在靶标-关键功能及通路”网络。

通过检索TCMIP V2.0、OMIM 和GeneCard 得到500 个RSA/APS 靶标，与ATF 的847 个靶标进行匹配，获得45 个ATF 治疗RSA/APS 的潜在靶标。这些潜在靶标主要作用于NF-κB 进入细胞核的正调节、炎症应答、生成IL-6 的正调节及趋化因子产生的正调控等功能。主要富集于核因子κB 信号通路和Toll 样受体信号通路等KEGG 关键信号通路。进一步构建“中药复方-成分-潜在靶标-关键功能及通路”的多维网络。通过分析，ATF 中的槲皮素、山奈酚、棕榈酸和β-谷甾醇等通过TNF、IL-6、IL-1B 作用于以上关键功能和通路。ZHAO 等［12］的研究发现，槲皮素通过调节TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路降低糖尿病周围神经病变模型大鼠的炎症反应。QU 等［13］研究证明，山奈酚可通过抑制LPSTLR4-NF-κB 轴减轻小鼠实验性结肠炎。TLR4/NF-κB 信号通路的炎性因子TNF-α、NF-κB 在RSA/APS 患者蜕膜、血清中的表达较正常孕妇显著升高，其可能参与了炎性、血栓生成的进程，与流产发生密切相关［14］。RSA/APS 大鼠血清及胎盘的IL-6 水平处于异常水平［15］。推测ATF 可能经TNFα、IL-6 等炎性因子调节TLR4/NF-κB 通路发挥治疗RSA/APS 的作用。

本研究团队在前期已对安子调冲汤的基础方，即减味寿胎丸治疗自然流产进行了网络药理学研究［16］。君药菟丝子的活性成分槲皮素，也是ATF的核心成分之一，为黄酮类化合物，有较好的ADMET 吸收水平。槲皮素可通过调节Bcl-2/Bax 蛋白的表达而抑制子宫内膜细胞凋亡，从而有利于胚胎着床［17］。槲皮素可抑制RSA 小鼠外周血Th1、Th2的数量以及IL-6、IL-8 的分泌，从而调节被破坏的免疫平衡［18］。槲皮素可以通过调节巨噬细胞数量和IL-10 的分泌改善脂多糖（LPS）诱导的RSA 小鼠的LPS所致的损伤作用［19］。槲皮素可抑制p38MAPK和JNK 磷酸化激活下游凋亡信号通路，起到保护滋养细胞的作用，同时有利于滋养细胞植入子宫内膜［20］。推测槲皮素在ATF 治疗RSA/APS 中也发挥重要作用。

本文通过整合药理学技术分析了安子调冲方治疗RSA/APS 的潜在作用靶标，并富集分析了靶标参与的生物过程，此外，构建了“中药复方-成分-潜在靶标-关键功能及通路”网络，阐释了ATF 治疗RSA/APS 的可能分子机制，为该方治疗RSA/APS 提供了临床依据，也为其体内外实验研究提供参考。