莲心碱体外吸收对Ang Ⅱ诱导血管平滑肌细胞表型转化的影响

贾沛芝，林 珊，2，曾建伟，2，熊晓满，刘 菲，王美玲，林 炜，2，陈达鑫，2*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州 350122）

高血压是常见病之一，全国调查发现，近年来我国成人高血压患病率逐年上升［1］。高血压引起的主要靶器官损害为血管、心脏、脑和肾脏损伤及其相关并发症［2］，而血管的功能性病变伴随着高血压的发生和发展，几乎是所有靶器官病理改变的使动环节。因此，对高血压血管病变的早期防治和药物开发，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。高血压导致的血管病变包括血管内皮损伤和血管重构两大方面。高血压引起血管重构的原因之一是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活引起的血管紧张素2（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）分泌异常时，血管平滑肌细胞（VSMCs）将发生增殖、迁移，由收缩型向合成型转变的表型转换，同时VSMCs 分泌胞外基质引起胶原增生，使动脉血管管腔内径狭窄，血管壁厚增加，动脉僵硬，导致血管由功能性病变发展为结构上的病理改变。VSMCs 表型转换在促进血管重构中发挥重要作用，α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是最常用的表型转换标志物，收缩型与合成型相比，收缩型α-SMA 的含量较高。高血压与血管功能损伤互为因果［3］。

清达颗粒由陈可冀院士治疗肝肾阴虚肝阳上亢型高血压的经验方清眩降压汤化裁而来［4］，全方由黄芩、天麻、钩藤、莲子心组成，具有清热泻火、平肝潜阳的作用。其中的莲子心（Nelumbinis Plumula）是睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）成熟种子中的干燥幼叶及胚根，性寒、味苦，归心、肾经，可平上亢之肝阳。《本草再新》中记载莲子心有“清心火、平肝火、泻脾火、降肺火。消暑除烦，生津止渴，治目红肿”的功效。莲子心的主要活性组分是莲子心生物碱，包括莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱和原荷叶碱等。现代药理研究表明，莲子心及其生物碱类成分具有降低血压、抗心律失常等作用［5］。莲心碱是莲子心中主要的双苯异喹啉类生物碱之一，具有抗癌、抗高血压、抗心律失常、抗氧化和抗炎等作用［6］。由于莲心碱水溶性不高，是否能通过磷脂双分子层进入细胞发挥其生物学作用的研究甚少。为了确定莲心碱的作用途径并进一步讨论莲心碱对高血压血管功能的保护作用，本研究通过超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）法测定不同浓度莲心碱进入A7R5 细胞的含量，并通过建立Ang Ⅱ诱导的A7R5 细胞表型转换模型，观察莲心碱对细胞表型转换的影响，为进一步阐述莲心碱治疗高血压及靶器官损害的作用机制奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验细胞 大鼠胸大动脉平滑肌细胞（A7R5），购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0316。

1.2 实验仪器 Q-TOF/MS 飞行时间质谱（德国布鲁克公司）；Agilent1290 UPLC 超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；双转盘活细胞共聚焦实时成像分析系统（美国PerkinElmer 公司）；AR2130 电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］；CP225D 电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ-300DB 台式数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；自动细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；Infinite200 PRO多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）；倒置显微镜（日本尼康公司）；荧光倒置显微镜系统（德国徕卡仪器公司）。

1.3 实验试药 莲心碱（C37H42N2O6）、MTT、台盼蓝染色液（北京索莱宝科技有限公司，批号：SL8100、M8180-250、C0040-100ML）；DMEM-高糖培养基、胎牛血清、双抗、胰酶、PBS（美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：C11995500BT、10099-141、SV30010、25200072、SH30256.01B）；α-SMA 抗体（美国CST 公司，货号：D4K9N）；山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor®647）预吸附二抗（英国Abcam公司，货号：ab150083）；乙腈（色谱纯，德国MERCK 公司）；甲醇及甲酸均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养与传代 A7R5 细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM 培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔天更换培养液，待细胞处于对数生长期时用于实验。

2.2 UPLC-Q-TOF/MS 法测定莲心碱进入细胞的含量 A7R5 细胞以1×105个/mL 的密度，接种于6 cm 培养皿中，每皿5 mL，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，吸取上清液，将细胞分为0、5、25、50、100、200 μg/mL 莲心碱组，分别加入含0、5、25、50、100、200 μg/mL 莲心碱的完全培养基，以0 μg/mL莲心碱组作为空白对照，继续孵育15 min 后消化收集细胞，经过5 次PBS 清洗，另收集200 μg/mL 莲心碱组最后1 次清洗的PBS 溶液（莲心碱PBS 清洗液）待测，考察经过清洗后的细胞外液中是否存在莲心碱残留；取50 μg/mL 的莲心碱标准品溶液设为莲心碱标准品组作为标准品对照。用甲醇破碎细胞膜，沉淀细胞结构，14 000 r/min 离心，弃沉淀，收集各组上清液为待测样品。

UPLC-Q-TOF/MS分析应用Agilent 1290 Infinity UPLC系统和micro TOF Ⅱ检测细胞内的莲心碱含量。采用Agilent UPLC 300 Extend-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）分析。流动相由0.1%甲酸/水（流动相A）和乙腈（流动相B）组成，梯度程序为：洗脱液A 98%～98%，洗脱液B 2%～2%，洗脱时间为0～5 min；洗脱液A 98%～20%，洗脱液B 2%～80%，洗脱时间为5～30 min；洗脱液A 20%～2%，洗脱液B 80%～98%，洗脱时间为30～35 min，进样量2 μL，流速为0.2 mL/min，柱温为30 ℃。质谱测定采用负离子模式，离子源电压3.0 kV；干燥气流速6.0 L/min；喷雾干燥机温度180 ℃；扫描范围78～1 800 m/z，Bruker Anglysis 系统对样本进行检测和鉴定。基峰色谱图（BPC）显示样品或标准品中的成分。

2.3 MTT 法测定不同浓度莲心碱对A7R5 细胞活力的影响 A7R5 细胞以1×105个/mL 的密度接种于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，吸取上清液，换成空白培养基孵育4h。吸去上清液后，将细胞分为0、5、25、50、100、200 μg/mL 莲心碱组，分别加入含0、5、25、50、100、200 μg/mL 莲心碱的完全培养基，继续孵育24 h 后，吸去上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL。37 ℃继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入100 μL 二甲基亚砜（DMSO）充分振荡10 min 溶解结晶，用酶标仪在490 nm 处测定吸光度。

2.4 免疫荧光法检测A7R5 细胞中α-SMA 的蛋白表达 将A7R5 细胞以5×104个/mL 的密度接种至20 mm 直径的共聚焦小皿中，接种培养体系为1 mL，细胞摇匀后置于细胞培养箱中培养12 h。12 h 后吸去上清液，将细胞分为空白对照组（完全培养基）、Ang Ⅱ组（1×10-6mol/L Ang Ⅱ）、莲心碱组（1×10-6mol/L Ang Ⅱ＋10 μg/mL 莲心碱），继续培养24 h 后，弃去皿中液体，PBS 清洗（5 min×3 次）。清洗后4%多聚甲醛固定20 min，弃上清，PBS 清洗（5 min×3 次）。使用0.1%Triton X-100 孵育5 min，弃液体，PBS 清洗（5 min×3 次）。之后每皿加入700 μL 封闭液，封闭1 h，封闭液中加入α-SMA 抗体（1∶100），4 ℃湿盒过夜。第2 天弃一抗，PBS 清洗（5 min×3 次）。结束后加入荧光二抗（封闭液1∶200 配置），避光常温孵育1 h，弃二抗，PBS 清洗（5 min×3 次）。之后用即用型DAPI 染液染细胞核15 min，PBS 清洗（5 min×3 次），最后用PBS 浸泡细胞，双转盘活细胞共聚焦实时成像分析系统对α-SMA 表达与DAPI 的核定位照片进行叠加（Merge），观察细胞表型转换标志物α-SMA 的表达与分布情况。

2.5 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件处理。计量资料符合正态分布以（xˉ±s）表示，采用单因素方差分析，若方差齐，采用T-test 法进行各组间两两比较；若方差不齐，则采用Games-Howell 法进行两两比较。

3 结 果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS 法测定莲心碱进入A7R5 细胞的含量 UPLC-Q-TOF/MS 法测定不同莲心碱浓度干预组（0、5、25、50、100、200 μg/mL）、最高浓度莲心碱干预组末次细胞清洗液及50 μg/mL莲心碱标准品。结果显示：测试样品分子式分析C37H41N2O6得分为100，且出峰时间与莲心碱标准品一致，确定细胞破碎后在14.0 min 时出现色谱峰为莲心碱，见图1。通过各组样品的峰面积及峰高计算莲心碱15 min 的进细胞效率。0 μg/mL莲心碱组及莲心碱PBS 清洗液组分析得出峰值为0，说明清洗细胞后细胞外无莲心碱残留，见图2；进入细胞样品率计算公式为：（50 μg 进细胞样品峰面积/50 μg 标准品峰面积）×100%，结果显示15 min 莲心碱进细胞率为15.56%，见表1。根据测试样品峰面积与莲心碱浓度绘制曲线图，结果显示不同浓度莲心碱进入细胞的含量与莲心碱的浓度呈对数增长关系，说明莲心碱浓度越高，进入细胞的含量越高且超过100 μg/mL后进入浓度饱和阶段，见图3。

图1 UPLC-Q-TOF/MS 鉴定A7R5 细胞液中莲心碱成分

图2 UPLC-Q-TOF/MS 法检测各组基础峰色谱图

表1 使用莲心碱浓度及细胞内液成分的色谱峰表现

图3 莲心碱干预浓度与细胞内液成分峰值曲线图

3.2 不同浓度莲心碱对A7R5 细胞活力的影响 为观察莲心碱对A7R5细胞株的毒性，使用MTT法检测不同浓度莲心碱对细胞活力的影响。5、25、50 μg/mL莲心碱组细胞活力与0 μg/mL 莲心碱组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），100、200 μg/mL 莲心碱组细胞活力较0 μg/mL 莲心碱组明显下降（P＜0.05），说明浓度为50 μg/mL 以下的莲心碱在24 h内对A7R5 细胞活力不存在影响，见图4。因此，选择＜50 μg/mL 的莲心碱浓度，可用于后续细胞实验的研究。

图4 不同浓度莲心碱对A7R5 细胞活力的影响

3.3 莲心碱对AngⅡ诱导A7R5 细胞α-SMA 的影响 与空白对照组比较，AngⅡ组A7R5 细胞中α-SMA 荧光强度明显降低；与AngⅡ组比较，莲心碱组α-SMA 荧光强度明显上升，见图5。

4 讨 论

高血压可引起多种靶器官与部位损害，血管重构为诸多病变之一。研究表明，人体处于高血压状态时，血管中层的VSMCs 发生增殖、迁移、凋亡、由收缩型向合成型转变的表型转换、胶原沉积，由功能性改变到结构性改变，从而产生血管重构。AngⅡ引起的VSMCs 表型转换在引起高血压血管重构中发挥重要作用。VSMCs 分为收缩型与合成型，收缩型主要功能为分布血流和调节血压，合成型表现为高度增殖。成年动物血管中膜里的VSMCs表现出正常的收缩表型，增殖率极低。处于高血压等疾病状态、胎儿期或血管生成过程中的VSMCs以合成表型存在［7］。合成型的VSMCs 可从中膜迁移至内膜，并在内膜中大量增殖，使血管管壁增厚、管腔变窄、血管顺应性下降、外周阻力增高，血压升高，形成高血压等疾病［8］。血管重构加剧高血压的发生，形成恶性循环。因此本研究将A7R5 细胞作为研究对象，通过测定莲心碱进入细胞的含量及莲心碱对细胞表型转换的抑制，从而为莲心碱的降压作用及血管保护作用的研究奠定基础。

图5 3 组A7R5 细胞α-SMA 蛋白荧光免疫图（×600）

莲心总碱作为莲子心的活性成分，具有降低自发性高血压大鼠的血压，通过RhoA/ROCK 通路改善高血压大鼠腹主动脉收缩力及血管重构的作用［9］。而莲心碱是莲心总碱的主要成分之一，自1962 年被我国学者首先从莲子心中分离得到后受到心血管领域研究工作者的关注［10-11］。对莲心碱的药代动力学研究表明，莲心碱静脉注射在大鼠体内后可分布在心、脑、肾及脾等主要脏器，但是不能穿过血脑屏障，说明莲心碱可以进入体内发挥作用［12］。莲心碱可有效降低肾性高血压大鼠的血压，还可治疗心律失常，其机理是通过抑制钾电流和钙电流，使动作电位时程适度延长，从而提高了心律失常的治疗效率，为治疗室性心律失常的药物提供了潜在的药理学基础，同时这也可能是莲心碱降压的机制［13-14］。此外莲心碱可以抑制去甲肾上腺素诱导的依赖内钙释放的兔子离体动脉环收缩［15］，对组胺诱导的猪冠脉平滑肌细胞依赖内钙性收缩与氯化钙诱导的依外钙性收缩均具有抑制作用［16］，可以有效抑制KCl 诱导的离体肠系膜血管平滑肌（VSM）收缩［17］，这些研究表明莲心碱可能是异常平滑肌收缩的潜在松弛剂。综上所述，莲心碱具有重要临床研究意义，可降低血压，起到血管保护的作用。但是目前由于莲心碱不溶于水的特点及降压、血管保护作用的机制尚不明确。

UPLC-Q-TOF/MS 因其高分辨率和精确的质量测量，通过多级质谱与参考化合物的比较，可以鉴别出未知成分，目前已成为国际公认的药物成分及药代动力学分析工具之一。本研究通过UPLCQ-TOF/MS 法测定莲心碱进入A7R5 细胞的含量，结果显示莲心碱在15 min 时进入细胞的效率为15.56%，说明莲心碱水溶液可以经过细胞膜进入细胞从而发挥作用；并且通过激光共聚焦显微镜的观察，确定了莲心碱能够抑制AngⅡ引起的A7R5 细胞由收缩型向合成型转化，从而证明莲心碱对血管平滑肌细胞的保护作用，为后续研究莲心碱防治高血压，同时保护高血压血管功能机制研究奠定实验基础。