烟台产区酒渣葡萄籽原花青素含量 与抗氧化性研究

◎ 杨亚超，宁梦帆，菅 蓁

（1.烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司，山东 烟台 264001；2.滨州医学院药学院（葡萄酒学院），山东 烟台 264003）

葡萄酒产品生产中会产生大量葡萄皮渣，葡萄酒皮渣是葡萄酿酒后的副产物，其中主要包括葡萄皮、葡萄籽和酒泥等[1]。酒渣的葡萄籽中仍保留了一部分生物活性物质，如原花青素、白藜芦醇、酒石酸等。原花青素（Procyanidin，PC）由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成，可以阻止自由基在体内产生的途径，达到抗氧化效果，是国际公认的最有效的清除体内自由基的天然抗氧化剂，具有抗衰老、抗肿瘤、保护心脑血管和增强免疫等多种作用[2]。葡萄酒酿造产生的大量葡萄皮渣主要用于动物饲料，会造成资源的浪费。葡萄皮渣还可用于多酚类活性物质的提取，但因技术不成熟、工业化成本较高而难以实现。本文以烟台产区5个品种的酒渣葡萄籽为研究对象，测定其原花青素含量以及抗氧化能力，以此为依据，针对不同品种的酒渣采取不同的处理方法，以期提高我国酿酒葡萄废弃物的利用率，为葡萄酒加工产业提供新的增值方向。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

选自烟台产区的白玉霓酒渣葡萄籽、赤霞珠酒渣葡萄籽、贵人香酒渣葡萄籽、蛇龙珠酒渣葡萄籽和霞多丽酒渣葡萄籽；PC标准品（纯度≥98%）（西安皓源生物技术有限公司）；甲醇（天津市富宇精细化工有限公司）；无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）；石油醚（天津市北辰方正试剂厂）；盐酸（烟台三和化学试剂有限公司）；香草醛（天津市光复精细化工研究所）；冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司）；醋酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；ABTS （上海源叶生物科技有限公司）；过硫酸钾（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL 16M离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；HH系列数显恒温水浴锅（北京市华瑞科学器材有限公司）；真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；FCA502电子天平（济南恒则成仪器有限公司）；紫外-可见分光光度仪（美国安捷伦公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 原花青素标准曲线的绘制

采用郑永丽[3]的方法，向烧杯中加入0.100 0 g的原花青素标准品，用甲醇溶解后转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容。分别量取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、 2.0 mL和2.5 mL原花青素标准品溶液，放于25 mL容量瓶，用甲醇定容。量取上述5个浓度的标准品溶液各1 mL置于试管中，向试管中加入5%香草醛溶液3 mL和4%盐酸1 mL，再取1 mL甲醇溶液加入5%香草醛溶液3 mL和4%盐酸1 mL作为空白对照。摇晃均匀后进行遮光处理，放入水浴锅中，30 ℃下反应30 min。将上述反应完成的溶液，在500 nm的波长下测量吸光值，绘制原花青素的标准曲线。

1.3.2 酒渣葡萄籽原花青素的提取及含量测定

（1）原料预处理。分别取一定量葡萄籽清洗干净后烘干，研磨后过60目筛，葡萄籽粉按照1∶5的比例用石油醚脱脂24 h，干燥后避光保存[3-4]。

（2）酒渣葡萄籽原花青素的提取。称量3 g脱脂葡萄籽粉倒入三角瓶里，以70%的酒精作为提取剂，料液比1∶30，充分混合后，放入超声波清洗器中。在400 W、30 ℃的条件下提取40 min，将提取液离心 （转速6 000 r·min-1，离心20 min），取上清液，即得到样品提取液[5]。

（3）酒渣葡萄籽原花青素的含量测定。采用香草醛-盐酸法测定酒渣葡萄籽原花青素含量[6]。取 0.05 mL样品提取液，甲醇定容至100 mL，得到稀释液。在试管中加入稀释液1 mL、5%香草醛溶液3 mL、4%盐酸溶液1 mL，遮光条件下在30 ℃水浴锅中反应30 min，在500 nm波长下测定稀释液的吸光度，并利用标准曲线得到提取液中原花青素的质量浓度。

1.3.3 酒渣葡萄籽原花青素ABTS自由基清除实验

ABTS被氧化后会生成阳离子自由基，呈蓝绿色，在抗氧化物存在时，ABTS自由基的产生会被抑制而发生褪色反应，所以在734 nm下测定其吸光度值则可计算出样品的总抗氧化能力[5]。用醋酸和醋酸钠配制pH值为4.5的醋酸盐缓冲液，再配制 2.45 mmol·L-1过硫酸钾溶液以及7 mmol·L-1的ABTS溶液，按照1∶1比例混合，常温避光静置12～16 h，得到ABTS自由基阳离子基液。使用缓冲液稀释，在波长734 nm处测得吸光度为0.700±0.002，得到ABTS的工作液[5-6]。取该工作液4 mL置于试管中振荡，同时缓慢向试管中滴加样品母液，直至颜色全部褪去，此时样品的消耗量为2 mL，即最大添加量为2 mL。依据最大添加量可设定6个不同浓度梯度，取6个盛有 4 mL ABTS工作液的试管，分别向试管中加入0 mL、 0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL及2.0 mL样液，不足2 mL的用甲醇补足，摇晃均匀后静置反应20 min， 于734 nm波长下测定吸光度Ai。以甲醇为空白对照，代入以下公式获得还原率，ABTS自由基清除率为：

（1）从问卷调查显示，学习有了更大的自主权，比以前更有乐趣。70.3%的学生认为这种方式能提供自主学习能力的提高。

式中：A0为空白样吸光度；Ai为试样吸光度。

2 结果与分析

2.1 酒渣葡萄籽原花青素含量的评价

2.1.1 原花青素标准曲线

由图1可知，在4～20 μg·mL-1，测得原花青素的标准曲线方程为Y=0.005 6X+0.000 7，R2=0.996 8，结果表明原花青素质量浓度与吸光度呈较好的线性关系。

2.1.2 原花青素含量测定结果

5个品种酒渣葡萄籽原花青素含量如图2所示。5种酒渣葡萄籽中原花青素的含量分别为白玉霓 82.7 mg·g-1、赤霞珠77.4 mg·g-1、贵人香114.2 mg·g-1、蛇龙珠188.7 mg·g-1以及霞多丽112.5 mg·g-1。原花青素含量最低的为赤霞珠，其含量为77.4 mg·g-1，蛇龙珠酒渣中原花青素的含量最高，为188.7 mg·g-1。

2.2 ABTS自由基清除力评价

不同品种酒渣葡萄籽原花青素的ABTS自由基清除力如图3所示，随着加入样液体积的不断增加，其对ABTS自由基的清除率也逐渐增大，蛇龙珠清除自由基能力最强，在加入样液1.2 mL后其清除率的增长幅度趋于平缓。在加入相同体积样液的情况下，样品对ABTS自由基清除力大小依次为蛇龙珠＞贵人香＞霞多丽＞白玉霓＞赤霞珠，蛇龙珠、贵人香、霞多丽和白玉霓的最高清除率可达到100%。

3 结论与讨论

在红葡萄酒的酿造过程中葡萄的皮渣得到浸渍，皮渣中的原花青素因为皮渣进入酒中而损失。但蛇龙珠酒渣葡萄籽中的原花青素含量却达到了188.7 mg·g-1， 推测皮渣中原花青素的含量主要是由酿酒葡萄品种自身来决定，今后可以对同一品种采用不同酿造方式的酒渣葡萄籽进行实验，进一步探索酿造方式对酒渣葡萄籽原花青素含量的影响[7]。

在物质的抗氧化性研究中，通常通过脂质的氧化降解、自由基的清除、螯合金属离子以及利用物质还原能力等机理进行体外研究。本实验对酒渣葡萄籽中的原花青素抗氧化性研究仅通过测试其ABTS自由基清除能力来实现，方法较为单一，后续可使用FRAP法测试酒渣葡萄籽对铁离子的还原能力，并以此为依据来综合评定酒渣葡萄籽原花青素的抗氧化能力。