番茄红素对SD大鼠在体心脏缺血再灌注损伤的影响及其作用机制

雷蕾 雷燕 胡厚祥

(川北医学院附属医院 1心内科，四川 南充 637000；2检验科)

近年来，心血管疾病的发病率呈逐年上升趋势〔1,2〕。心肌缺血再灌注(IR)损伤的发生是心肌长时间处于缺血状态后，供血突然恢复造成的更为严重的心肌损伤，心肌IR损伤不仅存在于心肌缺血重新恢复血流供应，还存在于血液循环障碍与心肺脑复苏过程〔3,4〕。目前关于引起心肌IR损伤的机制与钙超载、自由基生成过多、炎性细胞浸润、三磷酸腺苷(ATP)的衰竭密切相关〔5〕。研究发现，线粒体内膜心磷脂(CL)与细胞线粒体途径细胞损伤有密切关系，提示CL可能是参与调控机体线粒体途径信号传递及损伤的重要分子〔6〕。番茄红素是广泛存在于植物中的一种天然色素，具有较强的抗氧化作用，能清除体内自由基，在一定程度上能抵抗炎症反应和氧化应激损伤，减少心血管疾病的发生〔7〕，但是其作用机制目前尚未见文献报道，本研究通过建立SD大鼠在体心脏IR损伤模型，探讨番茄红素对心脏IR损伤的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康成年SD雄性大鼠，60只，体重180～210 g，购自川北医学院实验动物中心，实验动物饲养于恒温、恒湿的动物室内，自由饮食、进水。实验前12 h对大鼠进行禁食，但可自由饮水。

1.2试剂与仪器 番茄红素(≥90.0%，分析纯，Cas号：502-65-8)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，戊巴比妥钠(≥90.0%，分析纯，Cas号：57-33-0)购自武汉东康源科技有限公司；伊文思蓝、硝基四氮唑蓝(NBT)购自上海如吉生物科技发展有限公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-6等；乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒均购自上海高创化学科技有限公司，TransScript Two-Step逆转录(RT)聚合酶链反应(PCR)SuperMix与TransStart Top Green 定量(q)PCR SuperMix试剂盒及Western印迹所有试剂购自北京全式金生物技术有限公司。DW-3000小动物呼吸机购自成都泰盟软件有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与转膜仪均购自美国Bio-Rad公司，大鼠心电图机购自上海玉研科学仪器有限公司。

1.3心脏IR模型构建 SD大鼠随机分为假手术组、IR损伤组、番茄红素(1.5 mg/kg)+IR损伤组、番茄红素组各15只。番茄红素组与番茄红素+IR损伤组在术前15 d开始给药，其他组给予生理盐水，1次/d。术前对大鼠禁食12 h，自由饮水。按照30 mg/kg的比例通过腹腔注射戊巴比妥钠，对大鼠进行麻醉处理。麻醉后的大鼠将其仰卧固定在手术台板上，对皮肤进行备毛，利用碘酒、酒精对手术区域的皮肤进行消毒处理，连接心电图机，检测大鼠手术过程心电图变化，从颈部正中将大鼠气管切割开进行插管，同时给予动物呼吸机支持呼吸，潮气量30 ml/kg，机械通气频率为60～70次/min。于左侧胸前第四第五肋间将皮肤横向切割3 cm左右，将肋间第一二层肌肉剪开，逐层分离皮下组织、肌肉，于第4肋间开胸，将心包剪开，使心脏、血管暴露。在肺动脉圆锥和左心耳之间，将左冠状静脉作为标志，由左心耳根部下方2 mm的位置进针，进针深度约为0.5 mm，将缝线穿过心肌表层，由肺动脉圆锥的位置出针，丝线两端带聚乙烯小管，将细线拉紧，止血钳夹闭小管将前降支阻断。造模成功的标志为观察到左心室前壁组织由红色变为苍白色，以I、avL导联ST段弓背向上抬高，并且持续时间30 min后将止血钳松开，ST段下降说明心肌再灌注成功。

1.4心肌梗死面积检测 再灌注24 h后将冠状动脉进行原位结扎，从主动脉逆行灌注3 ml 1%的伊文思蓝，保证非缺血区心肌能够染色完全，放置于-80℃冰箱进行冷冻处理20 min左右后，心肌沿心尖向心底部的方向将左心室进行切片，厚度为2～3 mm，之后放置于含0.5% NBT的磷酸盐缓冲液中，37℃恒温水浴条件下孵育10 min后将平整的心肌切片利用10%的多聚甲醛溶液进行固定。多聚甲醛固定后24 h对染色的心肌进行拍照，利用Image Pro Plus软件进行分析，蓝色代表非缺血区域，红色代表缺血区域，白色代表心肌梗死区域。心肌梗死面积=梗死区面积/缺血区面积×100%。

1.5血清心肌酶谱指标、血清氧化应激损伤指标及炎症因子检测 心肌再灌注3 h后，在大鼠左心室取血2 ml，利用离心机4 500 r/min，离心10 min，离心半径为15 cm，取上层血清，利用ELISA试剂盒检测炎症因子TNF-α、CRP、IL-6，血清心肌酶谱指标LDH、CK，血清氧化应激损伤指标SOD及MDA变化水平。

1.6定量实时(qRT)-PCR检测线粒体相关蛋白在mRNA水平表达 称取100 mg心肌组织，液氮中快速研磨成粉末状，利用Trizol试剂提取总RNA，获得的RNA立即放置于冰上，利用紫外分光光度计，检测RNA的浓度与质量。取1 μg RNA(剩余RNA储存于-80℃冰箱)，利用TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix试剂盒说明书将RNA反转得到cDNA，-20℃冰箱保存 。采用qRT-PCR对miR-29b和Tiam1进行相对定量分析，qRT-PCR扩增采用TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒，PCR体系参照说明书进行，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，模板0.5 μl，STBR Premix Ex Taq Mix 10 μl，总体系为20 μl。反应程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s(每次循环后采集荧光)，进行40个循环。数据分析利用Bio-Rad CFX Manager软件，根据溶解曲线判断RT-PCR产物的特异性，相对定量分析采用2-ΔΔCt方法进行分析。定量PCR所用引物：Drp1上游5′-GCTGCCTCAGATTGTCGTA-3′，下游5′-TCTCCAACTACACACGGGA-3′；Mfn上游5′-CCATAAGGTGAATGAGCGG-3′，下游5′-AAGCATTCAGTTTC-ACGGAC-3′；Opa1上游5′-CACAGTATCAACAT-CTCG-TCC-3′，下游5′-CTTCACACTAACATCGCCC-3′；其内参引物GAPDH上游5′-CCCAAACTAACCGTTGTCCCA-3′，下游5′-TCCTTCACCTGCCCATAACC-3′，每个样品重复3次。

1.7Western印迹分析检测线粒体相关蛋白的表达 取心肌组织100 mg，加入1 ml裂解液，在低温匀浆机中匀浆，之后转移至1.5 ml离心管中，4℃低温离心机中12 000 r/min离心10 min，取上清即为获得蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测蛋白浓度。进行SDS-PAGE后，转膜，脱脂奶粉封闭，4℃孵育一抗过夜，过夜后的膜利用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗3次，10 min/次，室温条件下孵育二抗1 h，孵育二抗的膜利用PBST洗3次，10 min/次，利用发光液显色，使用化学发光凝胶成像系统进行图像扫描机数据分析，蛋白含量使用条带的灰度值进行表示，各组与内参基因GAPDH的比值表示蛋白的相对表达量。

1.8统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组心肌梗死面积比较 与假手术组〔(1.34±0.21)%〕和番茄红素组〔(1.28±0.16)%〕比较，IR损伤组心肌梗死面积〔(67.83±3.02)%〕显著增加(t=7 235.943、7 263.671，P<0.05)，与IR损伤组比较，番茄红素+IR损伤组心肌梗死面积〔(43.92±2.93)%〕显著降低(t=484.336，P<0.05)。

2.2血清心肌酶谱指标、氧化应激损伤指标及炎症因子比较 与假手术组及番茄红素组比较，IR损伤组CK、LDH、TNF-α、CRP、IL-6、MDA明显升高，SOD明显降低；与IR损伤组比较，番茄红素+IR损伤组CK、LDH、TNF-α、CRP、IL-6、MDA明显降低，而SOD明显升高(均P<0.05)，见表1。

2.3线粒体相关蛋白及mRNA表达比较 与假手术组及番茄红素组比较，IR损伤组Drp1、Mfn及Opa1蛋白及mRNA表达量明显降低，与IR损伤组比较，番茄红素+IR损伤组Drp1、Mfn及Opa1蛋白及mRNA表达量明显增高(均P<0.05)，见表2。

3 讨 论

心肌IR损伤是心肌在经历较长时间的缺血后突然恢复供血时，造成心肌损伤加重的一种病理现象〔8〕，该过程涉及多种细胞因子与信号级联途径的共同参与，此过程中多种病理过程相互协同作用，对机体的细胞、组织等造成严重损伤〔9〕。目前人们对心肌IR损伤的研究主要集中在氧化应激、钙超载、内质网应激、线粒体功能障碍、炎症、蛋白激酶、表观遗传改变、无复流、蛋白裂解产物及其他降解产物几个方面〔10〕，但是关于心肌IR损伤的机制仍不是很清楚，在临床上缺乏确切的治疗策略，因此对心肌IR损伤的进一步研究，寻找减轻再灌注损伤的内因与外因是目前国内外研究的热点。番茄红素为类胡萝卜素的一种，其在西瓜、木瓜等多种瓜果中广泛存在，具有抗氧化作用，对于预防心血管疾病疗效确切〔11〕。研究表明，番茄红素能使线粒体DNA免受氧化应激损伤，增加ATP合成，提高电子链传递活性，使线粒体膜电位处于稳定状态〔12,13〕，因此，可预测番茄红素在一定程度上能减轻心肌IR损伤。

本研究结果提示番茄红素具有显著的抗心肌IR损伤作用。番茄红素能清除体内自由基，具有较强的抗氧化能力〔14〕，对于大脑、肝脏IR具有明确作用，并且有体外实验表明，番茄红素还可抵抗心肌细胞复氧缺氧带来的损伤〔15～17〕。本研究结果提示番茄红素能通过降低炎症因子来抵抗心肌IR损伤，心肌IR损伤后，中性粒细胞能释放大量炎症因子，这些炎症因子之间相互作用，通过产生活性氧，释放出大量水解酶，造成心肌细胞凋亡，加重心肌IR损伤，在番茄红素的作用下，释放的炎症因子明显减少，说明番茄红素抗心肌IR损伤可通过降低炎症反应来实现，这与张璞等〔18〕研究结果类似。SOD作为一种金属蛋白酶，可通过歧化反应将超氧阴离子清除，将氧化应激反应造成的损伤降低〔19〕；MDA是脂质过氧化反应的终产物，其水平的变化在一定程度上能反映出组织中自由基水平及脂质过氧化程度〔20〕。氧化应激反应是造成心肌IR损伤的一大原因，含氧血液再次进入人体，能增加ATP的量，导致大量活性氧产生，从而氧化细胞中的所有生物分子，使细胞发生功能障碍〔21〕，番茄红素可增加体内SOD活性，降低MDA水平，说明番茄红素可通过减轻体内氧化反应、应激反应来降低心肌IR损伤。Drp1能介导线粒体分裂，调控线粒体形态，在心肌IR损伤过程中能够通过去磷酸通路的激活来使Drp1活化，破坏线粒体原有的结构与功能，使心室功能恶化，加重IR损伤〔22〕。番茄红素通过上调Drp1表达，能减少活性氧和过氧化氢的释放量，提升线粒体膜电位，增加ATP生成量，使线粒体维持正常的形态，减轻心肌IR损伤〔23〕。Mfn定位于线粒体外膜，在维持线粒体形态与介导线粒体外膜融合方面起重要作用〔24〕，心肌IR损伤常导致线粒体出现肿胀、膜破裂及嵴消失等现象，此时Mfn对于维持线粒体的形态发挥着重要作用，番茄红素通过上调Mfn表达，改善线粒体膜融合差现状，维持线粒体结构的完整性，降低心肌IR损伤，起到保护心肌的作用〔25〕。Opa1位于线粒体内膜，也能促进线粒体融合，维持线粒体形态，在稳定线粒体嵴、参与线粒体能力代谢、调控细胞凋亡等过程中发挥着重要作用，在心肌IR损伤过程中，其表达量明显降低，此时线粒体异常分裂增加，细胞凋亡现象增加〔26〕。番茄红素处理后，其表达量升高，说明番茄红素对于线粒体的修复具有重要作用，其可提高Opa1的活性，抑制线粒体凋亡通路，减轻心肌IR损伤〔27〕。

综上，番茄红素作为一种毒性低且安全的天然物质，对于SD大鼠心肌IR损伤具有较好的保护作用，其保护机制与抑制炎症反应、减少氧化应激、改善线粒体形态、提高线粒体代谢密切相关。