夏枯草通过miR-663a调控ILK对BRAF阳性甲状腺乳头状癌细胞侵袭的影响

陈红跃 武红园 娄永庆 杨萌萌 栗粟

(1河南省中医院甲状腺乳腺科，河南 郑州 450000；2河南中医药大学第二临床医学院外科学)

甲状腺乳头状癌(PTC)是常见的甲状腺恶性肿瘤病理类型之一，其发生与多种基因相关，研究表明鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)在PTC中存在普遍的突变与过表达，且BRAF突变型的PTC侵袭性强，预后差〔1〕。因此抑制细胞侵袭是治疗BRAF阳性PTC的重中之重。研究表明中药活性成分有抑制PTC的作用，如姜黄素可抑制PTC的TPC-1细胞侵袭和迁移〔2〕。夏枯草(PV)是临床常用中药，具有抗感染、免疫抑制、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种药理作用〔3〕。研究报道PV能抑制人PTC细胞K1和人甲状腺髓样癌TT细胞增殖并诱导其凋亡〔4，5〕。PV还能抑制PTC的TPC-1细胞增殖〔6〕。且PV提取物可抑制食管癌Eca-109细胞体外侵袭和转移〔7〕。但PV对BRAF阳性PTC细胞侵袭的影响及其机制尚不清楚。研究表明PTC患者血清中miR-663低表达，与PTC细胞侵袭和转移密切相关〔8〕。miR-663上调通过靶向转化生长因子(TGF)β1抑制PTC细胞的侵袭和迁移〔9〕。整合素连接激酶(ILK)是整合素和生长因子等多种信号通路中的效应分子，在肿瘤细胞的血管生成、凋亡、转移和细胞周期过程中发挥重要作用〔10〕。ILK影响PTC细胞的信号传导途径和迁移，并且是潜在的治疗靶标〔11〕。本研究旨在探讨PV通过miR-663a调控ILK对BRAF阳性PTC细胞侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1材料 正常甲状腺细胞HT-ori3和PTC细胞TPC-1购自上海泽叶生物科技有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国Sigma公司；PV颗粒(编号：B14000020441，国药准字：Z20050519，规格：2 g×8袋)产自江苏晨牌药业集团股份有限公司；细胞计数试剂盒(CCK)-8购自上海善然生物科技有限公司；Transwell小室、基质胶购自美国 Bio-Rad公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液购自上海羽朵生物科技有限公司；基质金属蛋白酶(MMP)-9、血管内皮生长因子(VEGF)、ILK、β-actin抗体购自上海斯信生物科技有限公司；山羊抗兔IgG二抗购自北京百奥莱博科技有限公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自北京麦瑞博生物科技有限公司；双荧光素酶报告检测试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司；Thermo FC酶标仪购自美国Thermo公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2细胞药物处理与分组 正常甲状腺细胞HT-ori3和PTC细胞TPC-1在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液中培养，取对数生长期细胞TPC-1，分别用浓度0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml的PV培养，作为不同浓度PV组，其中2.0 mg/ml PV组记为PV组；不作任何处理的细胞作为对照(Control)组。将anti-miR-con、anti-miR-663a、ILK过表达质粒转染至TPC-1细胞中，再用2 mg/ml PV处理，记为PV+anti-miR-con组、PV+anti-miR-663a组、PV+ILK组。

1.3CCK-8检测细胞增殖活力 各组培养48 h后，每孔中加入10 μl CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测各组细胞490 nm波长处的吸光度值(OD)。细胞增殖活力(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。实验重复3次。

1.4Transwell检测细胞侵袭 Transwell小室上室加入100 μl稀释的基质胶，十字摇匀，静置凝固；然后加入100 μl细胞悬液，其中下室加入500 μl含血清培养液，37℃培养24 h，0.1%结晶紫染色30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2遍，棉签擦拭掉上层未穿过基底膜的细胞，光学显微镜(×200)下随机选择5个视野，拍照记录并进行细胞计数。实验重复3次。

1.5Western印迹检测MMP-9、VEGF、ILK蛋白表达 提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至聚偏氟乙烯膜上，封闭液室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，电化学(ECL)发光液显影，ChemiDoc XRS+系统成像，Quantity One分析蛋白条带灰度值，蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/β-actin条带灰度值。每个蛋白样品设3个重复。

1.6实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-663a和ILK mRNA表达水平 各组细胞培养48 h，提取总RNA，将RNA反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，每个样品设3个重复，循环条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。miR-663a和ILK分别以U6和β-actin为内参，miR-663a上游引物：5′-AGCAGAGGCGGGGC-GCCGCGGG-3′，下游引物：5′-GTGCA GGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3′；ILK上游引物：5′-GGCTCAGGAT TTTCTCGCA-3′，下游引物：5′-CTGCTGAGCGTCTGTTTGTG-3′；β-actin上游引物：5′-TGGATGATGATATCGCCGC-3′，下游引物：5′-GTAGATGGGCACAGTGTGGGT-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7双荧光素酶报告实验验证miR-663a和ILK的靶向关系 使用PCR扩增包含miR-663a结合位点的ILK序列片段，并构建至荧光素酶表达载体中，获得ILK野生型载体，将ILK序列GCCCCGCC突变为CGGGGCGG，获得ILK突变型载体，将其分别与miR-con、miR-663a共转染至TPC-1细胞中，转染48 h后，按照双荧光素酶报告检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1PV对BRAF阳性PTC细胞TPC-1增殖的影响 与Control组细胞活力〔(1.07±0.08)%〕比较，0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml PV组〔(0.91±0.07)%、(0.79±0.06)%、(0.56±0.04)%、(0.40±0.04)%〕均显著降低(P<0.05)。后续实验选择浓度2.0 mg/ml的PV。

2.2miR-663a和ILK在TPC-1细胞中的表达 与正常甲状腺细胞HT-ori3相比，TPC-1细胞中miR-663a表达水平显著降低，ILK mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western印迹检测ILK在TPC-1细胞中的表达

表1 miR-663a和ILK在TPC-1细胞中的表达

2.3miR-663a与ILK的靶向关系 StarBase数据库预测显示miR-663a与ILK存在结合位点，见图2。荧光素酶报告实验显示，与miR-con组相比，miR-663a组转染野生型表达载体WT-ILK的TPC-1细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染突变型表达载体MUT-ILK的TPC-1细胞荧光素酶活性无显著差异(P>0.05)，见表2。

图2 miR-663a与ILK的结合位点

表2 双荧光素酶实验

2.4PV通过miR-663a抑制ILK的表达 与Control组相比，PV组miR-663a表达水平显著升高，ILK mRNA和蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。与PV+anti-miR-con组相比，PV+anti-miR-663a组miR-663a表达水平显著降低，ILK mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图3，表3。

1～4：Control组，PV组，PV+anti-miR-con组，PV+anti-miR-663a组图3 Western印迹检测PV和miR-663a对TPC-1细胞ILK表达的影响

表3 PV和miR-663a对TPC-1细胞ILK表达的影响

2.5PV通过miR-663a调控ILK对TPC-1细胞增殖、侵袭的影响 与Control组相比，PV组细胞活力显著降低，侵袭细胞数、MMP-9、VEGF表达水平均显著降低(P<0.05)；与PV组相比，PV+anti-miR-663a组和PV+ILK组细胞活力显著升高，侵袭细胞数、MMP-9、VEGF表达水平均显著升高(P<0.05)。见图4，图5，表4。

1～4：Control组、PV组、PV+anti-miR-663a组、PV+ILK组图4 PV通过miR-663a调控ILK对TPC-1细胞侵袭相关蛋白表达的影响

图5 PV通过miR-663a调控ILK对TPC-1细胞侵袭的影响(结晶紫，×200)

3 讨 论

PTC是最常见的甲状腺恶性肿瘤，大部分经手术治疗后预后较好，但仍有一部分PTC具有高侵袭性，难治愈〔12〕。研究报道PV对不同病理类型的人甲状腺癌细胞均有不同程度的抑制增殖作用〔13〕。PV可能通过激活线粒体通路诱导人PTC细胞凋亡〔14〕。PV能抑制人甲状腺癌细胞系SW579细胞生长，并诱导细胞凋亡而阻止细胞周期〔15〕。本研究结果说明PV可抑制TPC-1细胞增殖、侵袭。血管生成是肿瘤生长、侵袭、转移的基础，VEGF可调控血管生成，与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关〔16〕。PTC组织中VEGF阳性表达率高，与TNM分期及有无淋巴结转移有关〔17〕。本研究结果表明PV抑制TPC-1细胞侵袭可能与VEGF有关。

研究表明miRNA参与PTC的多种生物学过程，与细胞侵袭性作用机制有关，还可作为临床诊断、复发监测及预后判断等标志物〔18〕。过表达miR-663a可显著抑制膀胱癌EJ和5637细胞的增殖、迁移和侵袭能力〔19〕。miR-663a通过调节TGFβ1抑制肝癌细胞的生长和侵袭〔20〕。本研究结果表明miR-663a低表达会促进TPC-1细胞增殖、侵袭；PV可能通过升高miR-663a的表达抑制TPC-1细胞侵袭。

研究显示miRNA通过与靶mRNA的3′UTR结合使靶基因降解或沉默，进而影响肿瘤的发生发展〔21〕。本研究结果说明PV可能通过miR-663a调控ILK的表达；ILK表达水平也会影响PV对TPC-1细胞侵袭的作用。且有研究报道VEGF和ILK均参与了胃癌细胞的生长、侵袭和转移过程，VEGF和ILK在胃癌中的表达存在正相关，ILK可能通过信号转导途径启动VEGF的表达，促进肿瘤早期的血管发生和形成〔22〕。提示ILK对TPC-1细胞侵袭的作用可能也与VEGF有关。

综上，PV可通过上调miR-663a进而下调ILK抑制BRAF阳性PTC细胞侵袭，且其可能与VEGF的表达有关。