薯蓣皂苷元抑制碘酸钠诱发ARPE-19细胞氧化应激反应

陈若冰 吴素琴 姜玥 刘宵达 周郦楠 陈再兴 徐晓萱

(1辽宁省基础医学研究所药理室，辽宁 沈阳 110101；中国医科大学 2药理教研室；3临床医学院)

在前期山药潜在功能挖掘中发现古方用山药具有明目作用〔1〕，干性年龄相关性黄斑变性(AMD)中医辨证属于目昏暗范畴，是老年常见病，晚期会引起不可逆的视力丧失，其发病机制主要为衰老、氧化应激等导致视网膜色素上皮层脂质沉积，色素紊乱，功能障碍。在现代药效学研究中发现山药中的重要物质薯蓣皂苷元具有强抗氧化、抗衰老的作用〔2〕，能够抑制高血脂、糖尿病的氧化应激反应〔3〕，抑制ARPE-19细胞的过度增殖和迁移〔4〕，但未见其对干性AMD作用的报道，本研究拟分析薯蓣皂苷元对ARPE-19细胞的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和ARPE-19细胞增殖、凋亡浓度的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)购于中国科学院细胞库。药物和试剂：薯蓣皂苷元购于四川省维克奇生物科技有限公司(批号：wkq19013103，纯度：HPLC≥98%)；碘酸钠购于四川省维克奇生物科技有限公司(批号：wkq19051704，纯度：HPLC≥98%)；DMEM 培养基、胎牛血清、青链霉素、CCK8试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒购于联科生物；SOD、MDA试剂盒购于北京达科为生物技术有限公司。仪器和设备：流式细胞仪(Beckman，CytoFlex)、酶标仪(上海三科仪器有限公司 318C)、二氧化碳培养箱(赛默飞，Thermo Heracell vios 160i)、分光光度计(德国/analytikjena，SPECORD®210 PLUS)、倒置显微镜(卡尔蔡司，Axio Vert.Al)、95℃恒温水浴箱(北京中西华大科技有限公司，m269382)、高速冷冻离心机(美国贝克曼公司，Allegra X-30R)。

1.2细胞培养 ①配制培养基：配制含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM 培养基；②细胞传代：细胞密度达80%～90%时，胰酶消化、传代。细胞置于5%二氧化碳培养箱中培养。

1.3药物配置 碘酸钠避光保存，取20 mg碘酸钠溶于10 ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，制备成浓度为2 mg/ml的碘酸钠溶液。薯蓣皂苷元组分别溶于PBS中制成浓度为10、20、40、80 μg/ml的薯蓣皂苷元溶液各10 ml。

1.4细胞分组 分为6组：正常培养组、碘酸钠预处理组和薯蓣皂苷元10、20、40、80 μg/ml剂量组；每组4个孔。

1.5实验方法 正常培养组常规处理培养，碘酸钠预处理组予碘酸钠2 mg/ml预处理，薯蓣皂苷元各组在予碘酸钠2 mg/ml处理的同时分别给予薯蓣皂苷元10、20、40、80 μg/ml进行处理。培养24 h后进行指标检测。

1.6CCK8测定细胞增殖 用0.5 g/L胰酶消化对数生长期细胞，于96孔板内接种细胞悬液(每孔1 000个细胞)，分别对各组加入实验药物，将细胞置于37℃，体积分数5% CO2饱和湿度培养箱内培养。培养24 h后分别添加10 μl CCK8试剂到每个孔内，再继续培养2 h，酶标仪波长设置为450 nm，重复3次测定每孔吸光度(OD)，取平均值。

1.7细胞SOD、GXH-PX、MDA含量测定 以上6组细胞培养24 h后，细胞取上清，胰酶消化约2 min，加培养液中止消化，用微量移液器将液体吸出转入至EP管，1 000 r/min离心10 min弃上清，在沉淀细胞中加入1 ml PBS轻轻吹打，1 000 r/min离心10 min弃上清，加入0.5 ml PBS，悬浮细胞，进行超声震荡破碎，稀释10倍后，按照SOD、GXH-Px、MDA试剂盒说明书，测定BCA蛋白浓度，测定各组细胞OD值，计算SOD、GXH-Px、MDA含量。

1.8细胞凋亡检测 按实验方案诱导凋亡，用预冷PBS离心洗涤，收集105个细胞。用双蒸水稀释5倍结合缓冲液为1倍工作液，5 μl FITC-Annexin V和10 μl碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min，取补充1倍结合缓冲液至500 μl轻柔涡旋混匀后。对各组细胞进行流式分析(A)。

1.9统计学分析 用SPSS22.0软件进行One-Way ANOVA、t检验。

2 结 果

2.1各组细胞增殖和凋亡浓度比较 各组细胞增殖和凋亡情况差异有统计学意义(F=0.082、0.665，均P<0.05)；从增殖浓度看，碘酸钠预处理组(11.34%±2.82%)低于正常培养组(25.65%±6.05%)及薯蓣皂苷元80(28.63%±3.02%)、40(27.37%±4.53%)和20 μg/ml剂量组(25.49%±4.88%)，差异有统计学意义(P<0.05)；正常培养组高于薯蓣皂苷元20、10 μg/ml剂量组(18.42%±6.22%)，低于薯蓣皂苷元80 μg/ml、40 μg/ml剂量组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。薯蓣皂苷元80 μg/ml剂量组高于10 μg/ml剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。从凋亡浓度看，碘酸钠预处理组(30.41%±5.51%)高于正常培养组(8.26%±2.75%)、薯蓣皂苷元各剂量组(10、20、40、80 μg/ml组分别为15.27%±2.70%、15.05%±1.00%、11.42%±0.73%、8.49%±1.53%)，差异有统计学意义(P<0.05)；正常培养组低于薯蓣皂苷元20、10 μg/ml剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；薯蓣皂苷元各剂量组凋亡浓度与剂量呈反比，且各组间差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组细胞凋亡浓度

2.2各组SOD、GXH-Px、MDA含量比较 6组细胞SOD、GXH-Px、MDA含量差异有统计学意义(P<0.05)。碘酸钠预处理组SOD含量明显低于正常培养组和薯蓣皂苷元80、40 μg/ml剂量组(P<0.05)；正常培养组明显高于薯蓣皂苷元10 μg/ml剂量组(P<0.05)；薯蓣皂苷元80 μg/ml剂量组明显高于薯蓣皂苷元20、10 μg/ml剂量组(P<0.05)；薯蓣皂苷元40 μg/ml剂量组明显高于10 μg/ml剂量组(P<0.05)。碘酸钠预处理组GXH-Px含量明显高于正常培养组和薯蓣皂苷元80、40 μg/ml剂量组(P<0.05)；正常培养组明显高于薯蓣皂苷元10 μg/ml剂量组(P<0.05)；薯蓣皂苷元80 μg/ml剂量组明显高于20、10 μg/ml剂量组(P<0.05)；其他各组间差异无统计学意义(P>0.05)。碘酸钠预处理组MDA含量明显高于正常培养组、薯蓣皂苷元各剂量(P<0.05)；MDA含量随薯蓣皂苷元浓度升高而降低，但各组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3 讨 论

色素上皮细胞是血-视网膜屏障的组成部分，参与脉络膜毛细血管与视网膜感光细胞之间的物质转运，具有营养光感受器，吞噬感光细胞碎片等作用，当氧化损伤、炎症等因素导致色素上皮细胞损伤时，视网膜色素上皮层脂质沉积及色素紊乱，逐渐出现视网膜色素上皮细胞功能障碍，玻璃膜疣增多，脉络膜新生血管形成。晚期疾病不可逆，导致失明，因此，色素上皮细胞损伤被学者们公认为干性AMD病理改变的始动环节〔5,6〕。在疾病早期积极干预，阻止视网膜色素上皮细胞的损伤是干预干性AMD病情进展的重要措施。氧化应激是导致视网膜色素上皮损伤的重要因素，氧化-抗氧化系统失衡，增多的氮自由基及高活性分子氧自由基在视网膜上皮细胞中堆积，促进视网膜上皮细胞凋亡和抑制增殖。

碘酸钠是一种无机氧化剂，使用碘酸钠进行造模是干性AMD研究者常用的方法，碘酸钠注射小鼠使视网膜细胞发生氧化应激，细胞形态、结构和功能改变，引起视网膜细胞的损伤和死亡〔7,8〕。本研究中碘酸钠引发视网膜上皮细胞氧化应激损伤，模拟AMD发生有效。薯蓣皂苷元是一种自然合成的甾体皂苷元，药属螺甾烷醇糖苷元，广泛存在于豆科和薯蓣科植物中〔9〕，是山药的重要活性成分，薯蓣皂苷元抗氧化作用的研究主要集中在免疫系统、心血管系统、消化系统及抗肿瘤治疗等方面〔10,11〕。本研究表明薯蓣皂苷元具有抑制碘酸钠损伤视网膜上皮细胞的功能，能促进视网膜上皮细胞增殖，阻止凋亡，说明薯蓣皂苷元具有抗氧化凋亡和促进增殖的作用，且与剂量正相关。

细胞的增殖和凋亡与细胞氧自由基关系密切，氧自由基活性极强，能引起细胞膜脂质过氧化，破坏细胞膜、细胞内蛋白质及核酸结构和功能，促使细胞凋亡，抑制正常增殖。氧自由基的含量与细胞内氧化-抗氧化系统有关〔12〕，抗氧化酶活性降低，可诱导视网膜色素上皮细胞内氧自由基堆积〔13〕，细胞内脂质过氧化，生成大量MDA〔14〕。SOD是细胞最重要的氧自由基清除剂，可清除细胞中过多的氧自由基。GSH-Px是一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的重要过氧化物分解酶。能保护细胞膜不受过氧化物损害。本研究结果表明薯蓣皂苷元具有增强SOD、GSH-Px活力的作用，且与剂量相关，薯蓣皂苷元80、40 μg/ml剂量组效果最明显。MDA含量是考察细胞受到氧化威胁的重要指标，本研究结果说明碘酸钠预处理组脂质过氧化、细胞损伤程度超过正常培养组和薯蓣皂苷元各剂量组，与碘酸钠能诱发视网膜上皮细胞发生氧化应激损伤相一致，也验证薯蓣皂苷元具有抗氧化作用。

综上，薯蓣皂苷元能抑制碘酸钠诱导的ARPE-19细胞氧化应激反应，能通过增加SOD、GSH-Px活力，清除氧自由基，降低MDA含量，保护ARPE-19细胞，促进增殖，阻止凋亡。且其抗氧化作用与薯蓣皂苷元剂量具有相关性，以80 μg/ml剂量组效果最明显。作为山药的重要活性成分，薯蓣皂苷元在氧化应激状态下对ARPE-19细胞的保护作用，也为山药的明目功能提供了现代药效学的实验室支持。