基于HPLC和NIRS建立快速检测盾叶薯蓣中3种皂苷含量的方法

陶晓赛，陈志红,2，谢彩侠,2*，张 娟,2*，龚海燕,2，刘庆普,2，雷敬卫,2

1河南中医药大学药学院；2河南省中药质量控制与评价工程技术研究中心，郑州 450046

盾叶薯蓣(D.ZingiberensisC.H.Wright)为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属植物，俗称黄姜、火头根等，根茎中含有薯蓣皂苷、三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷等大量的甾体皂苷类成分[1]，其含量的高低直接影响着药材质量的优劣[2]。盾叶薯蓣为我国特有品种，根茎中含有的薯蓣皂苷元含量为1.1%～16.15%，是合成避孕药、甾体激素类药物的重要原料[3]。盾叶薯蓣不仅作为提取原料，还作为治疗心脑血管疾病[4]的临床用药。盾叶薯蓣作为提取薯蓣皂苷元重要的药源植物和治疗心脑血管疾病的临床用药极大促进了盾叶薯蓣相关产业的发展。

由于药材需求量大，目前盾叶薯蓣已实现了大面积栽培，全国河南、湖南、湖北、陕西、甘肃等10多个省市60多个县市在发展盾叶薯蓣产业，基地面积已逾10多万公顷[5]。盾叶薯蓣为多年生药材，产地较多，研究发现生长环境及栽培年限对盾叶薯蓣药材的质量影响较大[6]，但关于不同产地盾叶薯蓣皂苷类成分的评价研究鲜有报道。另外，盾叶薯蓣中皂苷类成分的含量测定目前多采用HPLC法[7-9]，该方法分析过程中样品前处理较为复杂，分析时间较长、试剂用量较大，检测成本较高，不能实现盾叶薯蓣皂苷类成分的批量快速检测，因此，在盾叶薯蓣药材的收购过程中很难实现按质论价。NIRS是一种检测速度较快、操作简便、低消耗、绿色环保的分析方法，已广泛应用于中药材的质量控制中[10-12]。基于此，本研究首先建立了同时测定盾叶薯蓣中薯蓣皂苷、三角叶薯蓣皂苷及盾叶新苷的HPLC-ELSD方法，然后对全国不同产地盾叶薯蓣中三种甾体皂苷的含量进行测定，同时结合NIRS技术建立快速评价盾叶薯蓣中三种皂苷含量的方法，为盾叶薯蓣药材的质量评价及收购过程中实现“按质论价”提供科学方法。

1 材料

1.1 仪器

Nicolet 6700 型傅立叶变换近红外光谱仪(美国 Thermo 公司)；1200型HPLC仪(美国 Agilent 公司)；ELSD 2000 ES型蒸发光散射检测器(德国 Alltech 公司)；KQ-500B型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FW-100型高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)；DZKW-4型电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；101-3AB型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；予华牌循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；Milli-Q Reference 纯水机(上海和泰仪器有限公司)；CPA225D 型 十万分之一电子天平；万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

1.2 试剂

乙腈(色谱纯)(TEDIA公司)；甲醇(分析纯)(天津市富宇精细化工有限公司)；无水乙醇(分析纯)(天津市致远化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯)(TEDIA公司)；娃哈哈饮用纯净水(济南娃哈哈恒枫饮料有限公司)；三角叶薯蓣皂苷(成都克洛玛生物科技有限公司，生产批号：CHB17051，纯度：HPLC≥98%)；盾叶新苷(成都克洛玛生物科技有限公司，生产批号：CHB170718，纯度：HPLC≥98%)；薯蓣皂苷(成都曼思特生物科技有限公司，生产批号：MUST-17090203，纯度：HPLC≥98.78%)。所有对照品均符合含量测定要求。

1.3 样品

实验用样品分别从陕西安康市、陕西商洛市、湖北十堰市、湖北丹江口、湖南怀化沙湾乡、甘肃陇南、湖北宜昌市、河南南阳市采集盾叶薯蓣药材共101批，经河南中医药大学陈随清教授鉴定为盾叶薯蓣(D.zingiberensis)的根茎。去除泥沙等杂质，切片，于鼓风干燥箱中55 ℃烘干至恒重，粉碎后过65目药典筛，置于干燥器内备用。样品信息见表 1。

表1 盾叶薯蓣样品信息

2 方法与结果

2.1 不同产地盾叶薯蓣中三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷及薯蓣皂苷的含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱为C18(4.6 ×250 mm，5 μm)；以乙腈：水(60∶40)为流动相；流速为1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量为2 μL。蒸发光散射检测器(ELSD)参数：气体流量2.5 L/min，漂移管温度115 ℃，增益值为2。

2.1.2 对照品溶液制备

精密称定三角叶薯蓣皂苷1.38 mg、盾叶新苷1.93 mg、薯蓣皂苷1.69 mg，分别置于5 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，制备浓度分别为0.276、0.386、0.338 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

称取约2.0 g盾叶薯蓣根茎粉末，精密称定，置锥形瓶中，精密加入80%乙醇溶液50 mL，称重，85 ℃加热回流提取40 min，放冷，补足失重；摇匀，过滤，精密移取15 mL续滤液于蒸发皿中，浓缩至近干，残渣用甲醇溶解，转移并定容至5 mL容量瓶，摇匀、滤过，即得。

2.1.4 线性关系考察

用“2.1.2”项下制备的对照品溶液，将三角叶薯蓣皂苷对照品分别制成0.027 6、0.069、0.138 、0.276、0.345、0.414 mg/mL的梯度浓度；盾叶新苷对照品分别制成0.193、0.386、0.965、1.54 4、1.93 0、2.31 6 mg/mL的梯度浓度；薯蓣皂苷分别制成0.067 6、0.101 4、0.135 2、0.338、0.507、0.845 mg/mL的梯度浓度；按照“2.1.1”项下的色谱条件，分别进样测定三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷及薯蓣皂苷的峰面积，以峰面积积分值的对数值为纵坐标(Y)，以对照品浓度的对数值为横坐标(X进行线性回归，并绘制标准曲线，结果如表2所示。

表2 线性关系考察

2.1.5 精密度考察

精密吸取对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷、薯蓣皂苷的峰面积RSD值分别为2.2%、2.7%、2.9%。表明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性考察

将同一供试品溶液分别在样品制备后0、4、8、12、24 h按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，结果三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷、薯蓣皂苷的峰面积RSD值分别为2.3%、2.7%、2.7%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性考察

精密称取同一批宜昌样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算含量。结果三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷、薯蓣皂苷含量的RSD值分别为2.4%、0.5%、2.8%，说明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率考察

称取南阳2年生样品6份，每份约1.0 g，精密称定，分别置于锥形瓶中并精密加入适量三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷、薯蓣皂苷对照品溶液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积并计算平均加样回收率及RSD，结果见表3、4、5。由表3、表4、表5可知，三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷、薯蓣皂苷的平均回收率分别为99.80%、101.4%、99.30%，RSD分别为0.3%、0.6%、1.3%。

表3 三角叶薯蓣皂苷加样回收率考察结果

表4 盾叶新苷加样回收率考察结果

2.1.9 样品含量测定

取各样品按“2.1.3”项下制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件分别测定101盾叶薯蓣样品中三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷和薯蓣皂苷的含量，对照品及样品HPLC色谱图见图1，含量测定结果见表6。

图1 盾叶薯蓣样品(A)和对照品(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of D.zingiberensis sample ( A) and reference substance ( B )注：1.盾叶新苷；2.三角叶薯蓣皂苷；3.薯蓣皂苷。Note:1.Zingiberensis newsaponin;2.Deltonin;3.Dioscin.

表6 101份盾叶薯蓣样品中三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷、薯蓣皂苷含量测定结果

续表6(Continued Tab.6)

样品编号No.三角叶薯蓣皂苷Deltonin盾叶新苷Zingiberensis newsaponin薯蓣皂苷Dioscin样品编号No.三角叶薯蓣皂苷Deltonin盾叶新苷Zingiberensis newsaponin薯蓣皂苷DioscinS240.8970.7850.074S751.71 90.7190.119S250.5030.5050.031S760.5120.6220.109S260.2900.5910.072S770.4000.5140.118S270.4610.5810.116S780.3560.8720.056S280.3190.3930.086S790.3980.5290.065S290.4000.5070.102S800.4010.6390.080S300.4100.5300.103S810.5450.4370.069S310.4600.5220.110S820.5980.6900.109S320.4480.5220.109S830.4130.4010.054S330.3890.5940.080S840.4600.6640.088S340.2900.5310.072S850.4290.6830.110S350.3160.5620.099S860.3430.7450.095S360.4140.5660.111S870.2740.6840.070S370.5060.7030.122S880.3180.7260.083S380.4730.7140.097S890.3020.8340.130S390.6300.7030.093S900.2630.8170.107S400.5970.6970.116S910.4590.5250.080S410.7050.6670.116S920.3660.8770.138S420.7030.7990.137S930.3630.7900.141S431.03 90.9080.129S940.3771.02 30.136S440.5180.6440.093S950.3720.9580.136S451.08 60.8120.116S960.3360.9120.114S460.5630.5890.109S970.8340.8940.060S471.22 80.6620.104S980.4760.7090.047S481.06 80.6930.117S990.5421.00 40.033S491.23 90.7410.109S1000.5530.9390.051S500.9200.6610.099S1010.3950.7570.047S510.7100.8100.150

2.2 盾叶薯蓣样品NIR的采集

分别取盾叶薯蓣样品粉末适量平铺于近红外光谱石英样品杯中，采用积分球漫反射法，在分辨率8 cm-1、扫描次数64、扫描范围12 000～4 000 cm-1、温度25 ℃、湿度28%的采集条件下，扫描101份盾叶薯蓣样品的NIR，每份样品重复采集3次，取其平均光谱(见图2)。

2.3 三角叶薯蓣皂苷NIR定量分析模型的建立

首先，根据101份盾叶薯蓣样品中三角叶薯蓣皂苷的HPLC含量测定结果，将特异值和含量接近的样品剔除，保留三角叶薯蓣皂苷模型建立所用的有效样品。按照校正集与验证集样品比例约4∶1及验证集样品含量范围在校正集样品含量范围内的原则从有效样品中选择模型建立所用的校正集样品和模型验证所需的验证集样品。然后，将盾叶薯蓣校正集样品中三角叶薯蓣皂苷的HPLC含量测定结果作为参考值分别输入TQ Analyst 8.0分析软件，结合校正集样品的NIR，利用偏最小二乘法(PLS)，以R2、RMSEC、RMSEP及PI为评价指标，考察光谱预处理方法、光谱范围以及主因子数等对所建模型性能的影响，其中R2越接近1，RMSEP和RMSEC 值越接近于0、PI值越接近于100的模型适用性越强，预测结果越准确。最后，用所建模型预测验证集样品的三角叶薯蓣皂苷含量，以预测值与参考值的平均相对偏差和t检验结果，验证所建模型的推广能力和预测能力。

图2 101份盾叶薯蓣样品的NIR叠加图Fig.2 NIR overlay maps of 101 samples of D.zingiberensis

2.3.1 校正集与验证集的选择

通过分析盾叶薯蓣样品中三角叶薯蓣皂苷含量的分布特点及校正集与验证集样品的选择原则，最终确定98份样品用于其定量模型的建立及验证，其中78份为校正集，20份为验证集。校正集样品三角叶薯蓣皂苷的含量分布范围为0.209%～1.975%，平均值1.092%；验证集0.290%～1.177%，平均值0.734%。

2.3.2 光谱预处理方法的选择

不同产地及年限的盾叶薯蓣样品由于颜色、表面纹理、密度等物理性质的差异，会干扰其近红外光谱中与样品化学成分相关的光谱信息，而合适的光谱预处理方法可以有效消除物理因素的干扰，提高NIR与待测化学成分的相关性。本研究考察了不同光谱预处理方法对模型性能的影响(见表7)。综合分析表7中不同光谱预处理方法的R2、RMSEC、RMSEP和PI值，选择SNV+SD为建立三角叶薯蓣皂苷定量分析模型的最佳光谱预处理方法，原始光谱经最佳光谱预处理方法后所得的近红外光谱见图 3。

2.3.3 建模波段范围的选择

合适的建模波段可以避免冗余信息对有效光谱信息的干扰，提高所建模型的预测准确性。不同建模波段下模型的性能结果(见表8)显示，在9 036.80～5 186.92 cm-1的波段范围内，所建三角叶薯蓣皂苷的定量分析模型整体性能较好。

表7 不同光谱预处理方法对三角叶薯蓣皂苷定量分析模型性能的影响

注：MSC：多元散射校正，FD：一阶导数，SD：二阶导数，SG：滤波法，ND：直接差分法

Note:MSC:Multiplicative signal correction,FD:First derivative,SD:Second derivative,SG:Savitzky-Golay fillter,ND:Norris derivative filter

图3 Constant+FD预处理后近红外光谱图Fig.3 Near infrared spectrum of Constant+FD after pretreatment

表8 不同的光谱范围对三角叶薯蓣皂苷模型性能的影响

2.3.4 主因子数的选择

主因子数作为模型建立的重要参数，其取值的多少直接影响模型的预测性能。主因子数过多，会将代表噪音的主因子引入模型中，导致计算结果出现“过拟合”的现象，主因子数过少，则不能完全反映样品被测组分产生的光谱变化，使模型的预测性能下降[13]。本研究以RMSECV为优化参数，根据RMSECV值随主因子数的变化情况(见图4)选择合适的主因子数。结果显示，RMSECV最小值所对应的主因子数为6，且随着主因子数的增加，RMSECV值的变化趋于稳定，因此，选择6为建立三角叶薯蓣皂苷定量模型的最佳主因子数。

2.3.5 三角叶薯蓣皂苷NIR定量分析模型的建立

运用TQ Analyst 8.0分析软件结合PLS法，分别选择最优的光谱预处理方法、建模波段范围、最佳主因子数建立三角叶薯蓣皂苷的NIR定量分析模型，三角叶薯蓣皂苷模型的NIR 预测值与 HPLC 参考值的相关图及偏差见图 5。结果表明该模型的R2为0.981 1、RMSEC为0.086 3、RMSEP为0.063 8、RMSECV为0.320 26、PI为90.5，模型性能较好。

图4 三角叶薯蓣皂苷NIR模型主因子数对RMSECV 的影响Fig.4 Effects of principal factor numbers of deltonin NIR modle on RMSECV

图5 三角叶薯蓣皂苷NIR预测值与HPLC参考值的相关图(A)及偏差图(B)Fig.5 Correlation chart ( A ) and deviation chart ( B ) between NIR predicted value and HPLC reference value of deltonin

2.3.6 盾叶薯蓣中三角叶薯蓣皂苷定量分析模型的验证

将20份三角叶薯蓣皂苷验证集样品的近红外光谱图输入到所建立的定量分析模型中，将三角叶薯蓣皂苷的预测值与HPLC参考值进行比较(见表9)。结果表明，NIR模型预测的三角叶薯蓣皂苷含量测定结果与常规HPLC法测定结果接近，预测值和参考值的配对样本t检验结果显示t= -0.975，P= 0.342 > 0.05，因此，预测值和参考值在统计学上无显著性差异。该实验结果表明所建立的模型预测性能较好，可以用于盾叶薯蓣中三角叶薯蓣皂苷的含量测定。

表9 验证集样品三角叶薯蓣皂苷NIR预测值与 HPLC参考值的比较

2.4 盾叶新苷、薯蓣皂苷近红外定量分析模型的建立

根据盾叶薯蓣样品中盾叶新苷和薯蓣皂苷的含量分布情况，选择77份为校正集、18份为验证集用于盾叶新苷定量校正模型的建立及验证；选择72份为校正集、18份为验证集用于薯蓣皂苷定量校正模型的建立及验证。按照“2.3”项下三角叶薯蓣皂苷定量模型的建立方法分别对两个模型建立过程中的光谱预处理方法、建模波段范围及主因子数等条件进行优化，确定建模条件，并对模型进行验证。结果表明，在光谱预处理方法为SNV+SD+SG、建模波段为8 147.69～5 320.49 cm-1、主因子数为7的建模条件下，盾叶新苷定量分析模型的R2、RMSEC、RMSEP、RMSECV及PI分别为：0.982 64、0.042 0、0.027 4、0.141 21、91.1；在光谱预处理方法为MSC+SD、建模波段为9 253.34～5 787.98 cm-1、主因子数为4的建模条件下，薯蓣皂苷定量分析模型的R2、RMSEC、RMSEP、RMSECV及PI分别为0.943 64、0.009 90、0.005 41、0.024 14、85.8。经验证，两个模型的NIR预测值与HPLC参考值的绝对与相对偏差均较小，配对样本t检验结果的P值均大于0.05，说明预测值与参考值在统计学上无显著性差异，因此所建立的模型可以用于盾叶新苷及薯蓣皂苷的含量测定。盾叶新苷、薯蓣皂苷NIR定量分析模型的RMSECV 值随主因子数变化的曲线分别见图6、图7，NIR预测值与参考值的比较结果分别见见表10、表11。

图6 盾叶新苷NIR模型主因子数对RMSECV的影响Fig.6 Effects of principal factor numbers of zingiberensis newsaponin NIR modle on RMSECV

图7 薯蓣皂苷NIR模型主因子数对RMSECV 的影响Fig.7 Effects of principal factor numbers of dioscin NIR model on RMSECV

表10 验证集样品盾叶新苷NIR预测值与HPLC参考值的比较

续表10(Continud Tab.10)

样品编号No.参考值Reference value预测值Predicted value绝对偏差Absolute deviation相对偏差Relative deviationPS740.4960.480-0.016-0.032S800.6390.636-0.003-0.005S840.6640.6990.0350.053S960.9120.9460.0340.037S970.8940.9200.0260.029S1000.9390.911-0.028-0.030

表11 薯蓣皂苷NIR模型预测值与参考值的比较

3 讨论

药用植物次生代谢产物含量的高低从某种意义上来说是其种质与生态环境双重作用的结果[14]。盾叶薯蓣是一种药效成分比较明确的药用植物，喜温暖，不耐严寒。根据中国薯蓣属植物资源调查资料，盾叶薯预适宜生长于海拔100～1 500 m的河谷、山地、落叶阔叶混交林的边缘或稀疏的常绿灌木林内[15]，而生态环境对盾叶薯蓣形态性状与有效成分积累等方面影响较大。Li等[16]研究认为，盾叶薯蓣皂苷类成分的含量与居群环境存在一定的相关性，其中最主要的影响因素可能是海拔高度。本研究利用HPLC-ELSD法对全国主要产地盾叶薯蓣中三种皂苷类成分的含量进行分析，结果表明，不同产地样品中的3种甾体皂苷含量差别较大，其中陕西安康产盾叶薯蓣中三角叶薯蓣皂苷和盾叶新苷含量较高，湖南怀化产的薯蓣皂苷含量较高。虽然三种皂苷均属于甾体皂苷类成分，但其含量的变化规律并不一致，这可能是由于不同甾体皂苷生物合成途径中的关键酶基因存在差异，而且相同关键酶基因的表达受生态环境的影响较大。

NIRS是一种利用化学计量学软件从样品复杂的近红外光谱图中提取和样品待测性质相关的信息，建立图谱特征与待测性质之间关系的数学模型以实现快速预测样品特征的技术，它对样品的处理过程要求比较简单，因此可以在较短的时间内对样品的性状及质量做出初步的综合评价，是一种快速、无损的绿色分析方法。该方法的预测准确性取决于样品数量、待测性质的特征及待测性质参考值的测定准确性，其中样品的数量及代表性是决定所建模型预测性能好坏的前提。如果要对样品中某一化学成分的含量进行预测，则要求此化学成分具有较高的含量。本研究采集的盾叶薯蓣样品涵盖全国8个产地及不同的生长年限，具有一定的代表性，而且含量测定结果表明三种甾体皂苷的含量均相对较高，因此，可以利用近红外光谱法进行快速测定。经过基础数据的测定、建模条件的优选，本研究建立了可以相对快速、准确预测盾叶薯蓣根茎中三角叶薯蓣皂苷、盾叶新苷及薯蓣皂苷含量的近红外地定量分析模型，为盾叶薯蓣的质量快速评价提供一种可参考的方法，为盾叶薯蓣实现按质论价收购提供可能。