MTSS1及Gli1在食管鳞癌组织中表达及其相关性

何章彪 王翠侠 韩文杰 赵琳 陈奎生

(1商丘医学高等专科学校五官科，河南 商丘 476100；2商丘市第一人民医院肿瘤科；3郑州大学第一附属医院病理科)

肿瘤转移抑制基因(MTSS)1是由Lee等〔1〕通过改良的mRNA差异显示技术在研究膀胱癌转移机制过程中发现的一个新基因,该基因定位于人类染色体8q24.1区域,是一个转移抑制候选基因，编码5.3 kb的转录产物。胶质瘤相关癌基因蛋白(Gli)1是局域性蛋白质配体(Hh)信号通路的下游转录调控因子之一，其表达水平增高标志着Hedgehog信号转导通路处于激活状态，在正常情况中对Hh信号通路起正调控作用〔2〕。有关食管鳞癌组织中MTSS1和 Gli1蛋白表达及其意义尚未见文献报道。本文采用免疫组化和原位杂交法观察食管鳞癌组织中MTSS1和Gli1蛋白表达，探讨其与食管癌发生发展的关系及MTSS1和Gli1的相关性。

1 资料与方法

1.1实验标本 标本选取商丘市第一人民医院2018年6月至2019年12月经病理证实的手术切除新鲜食管鳞状上皮细胞癌标本，共计136例，男88例，女48例，年龄48～81岁，平均(64±5.1)岁，患者的临床及病理资料完整，术前均未进行化放疗和免疫治疗。患者签订知情同意书后进行病理取材，所取标本分别为远端正常黏膜组织、癌旁3 cm内组织、无坏死癌灶处组织，癌灶区标本病理证实为食管鳞状上皮细胞癌。136例癌旁组织中经苏木素-伊红(HE)染色发现有96例为中-重度不典型增生组织。按有无淋巴结转移分为：转移组74例和无转移组62例。所有标本取材后放入10%多聚甲醛固定(在固定液中加入0.1%二乙基焦碳酸酯以抑制RNA酶的活性)，病理标本经常规脱水、石蜡包埋后4 μm厚连续切片。对食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜分别进行HE染色、免疫组化和原位杂交染色。

1.2实验试剂 MTSS1抗体为鼠单克隆抗体，购自美国Abcam公司(ab56780)，工作浓度1∶130 稀释；Gli1抗体为兔单克隆抗体，购自美国Abcam公司 (ab49314)，工作浓度1∶200稀释，多聚体分子(Envision)免疫组化试剂盒(二K5007DAB显色系统)购自北京中杉金桥生物技术开发有限公司；胃蛋白酶、预杂交液及核固红均购自武汉博士德生物工程有限公司；碱性磷酸酯酶标记(SP-AP)及碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBT)购自美国Promega公司，MTSS1探针(5′-GGTCCACTGAGCCCCACACATTGTT-3′)，Gli1探针(5′-AGGAGCGGCGGCTGACAGTATAGGC-3′) 由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.3方法

1.3.1标本处理 食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织经40 g/L的多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组化及原位杂交检测。

1.3.2免疫组织化学 免疫组化SP法染色步骤按照试剂盒及一抗(浓度为1∶100)说明书要求进行，同时用购自美国Abcam公司(MTSS1和Gli1)的阳性对照片进行阳性对照及用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

1.3.3原位杂交 参照原位杂交试剂盒说明书操作，以不含探针的预杂交液进行杂交及杂交前用核糖核酸酶(RNase)处理样本作阴性对照〔3,4〕。

1.3.4免疫组化和原位杂交结果判定 在高倍镜视野下对目标区域连续计数200个细胞，计算阳性细胞数占全细胞数的百分比评分。阳性细胞所占比例<1%为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色深浅评分：样本无染色为0分；样本弱染色为1分；样本中等染色为2分；样本强染色为3分。将样本两者得分相乘记为总分。根据分数把样本界定为4类：0～1为阴性(-)，2～4为阳性(+)，5～8为中阳性()，9～12为强阳性()〔3,4〕。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行χ2检验、Spearman秩相关分析。

2 结 果

2.1免疫组化与原位杂交结果 MTSS1主要存在于细胞的细胞核/细胞质中，染色呈淡黄至棕黄色。MTSS1 mRNA阳性表达主要存在于细胞核/细胞质中，呈棕紫色颗粒。Gli1主要存在于细胞的细胞质中，染色呈淡黄至棕黄色。Gli1 mRNA阳性表达主要存在于细胞质中，呈棕紫色颗粒。见图1。

2.2食管鳞癌组织中MTSS1、Gli1的蛋白及mRNA表达 见表1。MTSS1蛋白及mRNA在食管鳞癌组织中呈低表达，在癌旁不典型增生组织与正常食管黏膜组织中呈高表达；Gli1蛋白及mRNA在食管鳞癌组织中呈高表达，在癌旁不典型增生组织与正常食管黏膜组织中呈低表达，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图1 食管鳞癌组织中MTSS1、Gli1蛋白及mRNA的表达(SP,×400)

表1 食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及其正常组织中MTSS1、Gli1蛋白及mRNA表达比较〔n(%)〕

2.3MTSS1及Gli1蛋白表达与食管癌转移的关系 见表2、表3。有淋巴结转移的食管鳞癌组织中MTSS1蛋白〔12例(16.2%)〕及mRNA表达〔6例(8.1%)〕均明显低于无淋巴结转移的相应组织〔28例(45.2%)、45例(72.6%)〕，Gli1蛋白〔68例(91.9%)vs 47例(75.8%)〕及mRNA表达〔64例(86.5%)vs 21例(34.0%)〕均明显高于无淋巴结转移的相应组织(均P<0.05)。

2.4MTSS1和Gli1的相关性分析 食管鳞癌组织中MTSS1蛋白与Gli1蛋白表达呈负相关(r=-0.422，P<0.001)。见表2。食管鳞癌组织中MTSS1 mRNA与Gli1 mRNA表达呈负相关(r=-0.389，P<0.001)。见表3。

表2 食管鳞状细胞癌组织中MTSS1与Gli1蛋白的表达情况(n)

表3 食管鳞状细胞癌组织中MTSS1与Gli1 mRNA的表达情况(n)

3 讨 论

3.1Hedgehog信号通路与食管鳞癌的关系 Hedgehog信号转导通路在进化上高度保守并有重要生物学功能。胞膜上的受体 Patched(Ptch1、Ptch2)、胞外配体Hh及跨膜蛋白(Smo)和细胞内部的下游转录因子锌指核转录因子Gli蛋白等组成了Hedgehog信号转导通路〔2〕。Hedgehog通路调控胚胎发育过程中的细胞分化和增殖。Hedgehog信号通路与肿瘤的发生发展有着密切联系，有关文献报道包括：前列腺癌、皮肤基底细胞癌、胃癌、白血病、小细胞肺癌等恶性肿瘤，在这些报道中提到了发现该通路存在异常的激活。在Hh通路上任何成员的突变或缺失都可能导致信号传递的改变〔3〕。目前已有文献报道该信号通路的异常激活与食管鳞状细胞癌的发生有着密切的联系〔4〕。信号传导分子Gli在Hh信号通路中起到重要作用，Hh通路末端的转录激活因子Gli1蛋白在Hh相关性肿瘤的发生、发展过程中起着必不可少的作用〔5〕。因此Gli 的表达水平可以作为反映 Hh信号通路活性的一个可靠指标，Gli1表达异常可以通过多种途径诱导肿瘤的发生、发展以及侵袭性生长。

本研究发现在食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织、正常食管黏膜中Gli1的蛋白的表达依次降低，这表明Hh信号通路与食管鳞癌的发生关系密切，Hh信号通路在食管鳞癌中活化这一观点得到了支持。通过Gli1蛋白的表达结果和临床病例资料对比分析显示，与肿瘤的浸润程度和有无淋巴结转移相关，这提示Hh信号通路有可能参与了食管鳞癌的侵袭性生长，可通对Hh信号通路调控来抑制肿瘤的生长。

3.2MTSS1与食管鳞癌的关系 目前对于MTSS1的作用和功能还存在一定的争议。早期研究〔6〕发现MTSS1在未转移的膀胱癌细胞中高表达，在高转移的膀胱癌细胞株中低表达，这提示在肿瘤侵袭和转移的过程中MTSS1有可能是一个有抑制能力的蛋白。MISS1可能作用于肌动蛋白细胞骨架，从而抑制癌细胞转移。但是有学者认为MISS1的低表达和肿瘤的侵袭性转移相关性有待进一步研究，MTSS1并非都是作为一个转移抑制因子存在，如Yao等〔7〕研究发现肝癌组织中MTSS1 mRNA及蛋白上调，且MTSSl是肝癌早期病变的诱导者,寇炜等〔8〕研究发现MISS1在膀胱癌中表达下降，但与膀胱癌的侵袭行为无关。张曙光等〔9〕采用免疫组化和RT-PCR等方法研究发现MTSS1在食管鳞癌组织和细胞低表达，这与本研究结果相一致。本研究提示MTSS1在食管鳞癌的侵袭性生长过程中可能作为一个抑制信号，但是其具体发挥的作用尚有待进一步研究。

3.3MTSS1在Hedgehog信号通路中的作用 MTSS1自从发现以来，多数学者认为其作为一种细胞骨架蛋白，其表达受到信号肽(Shh)的调控〔10〕。Shh作为Hh信号通路中的一种重要的信号肽，在哺乳动物中广泛表达，控制着不同类型祖细胞的比表达。Shh可以通过下游Gli信号分子控制细胞的生长、增值和分化，同时也参与了肿瘤细胞的增殖和扩散〔11〕。作为Shh通路上的相关基因MTSS1能够协同Gli转录从而激活Shh途径的转录〔12〕。在众多Gli的启动基因中，在多种组织系统中MTSS1可以促使其转录。MTSS1、Gli1/Gli2及Gli相关蛋白细胞内调控组分(Sufu)三者合成三元络合物，Gli介导的转录受到促进，进一步促进了成瘤和瘤体生长过程及肿瘤细胞增殖与侵袭〔13〕。所以MTSS1可能是Shh的一个靶基因，通过Shh途径参与肿瘤的发生发展。目前有关Hedgehog信号通路的研究，以该通路对肿瘤发生及瘤体生长的作用居多，但最近有关肝癌、卵巢癌、胰腺癌的研究中发现，过度活化的通路也会促进肿瘤的侵袭性生长和转移〔14〕。但MTSS1在该通路中如何促进肿瘤的生长、侵袭和转移的机制尚不明确。

本研究将食管鳞癌组织中MTSS1的表达和Hedgehog信号通路中重要的信号分子Gli1的表达对比分析显示，其蛋白表达呈现负相关。但在食管鳞癌的发生迁移过程中，MTSS1是否参与Hedgehog信号的表达调控及Hedgehog信号通路是否参与了食管鳞癌的侵袭性生长和迁移尚不甚明了。在食管鳞癌中，MTSS1的表达调控有可能和Hedgehog信号通路中的某些分子存在相互抑制作用，也有可能MTSS1只是在一定阶段或一定浓度下对 Hedgehog信号通路其调控作用，这些问题都有待于进一步讨论研究。