蛋白磷酸酶4在缺血性脑卒中大鼠肝、脑组织中的差异表达

田美媛 侯静 黄登亮 张耀刚 江源 孙莉 张涛 李志琴 童思贤 马艳艳,2

(青海大学 1附属医院中心实验室，青海 西宁 810000；2医学院；3附属医院科研管理部)

缺血性脑卒中急性期可出现多脏器功能损伤，严重时可引发多器官功能衰竭而增加致残率和死亡率〔1〕。脑损伤和肝脏应激性损伤是常见的受累脏器，并被认为是全身应激性炎症反应的始动和扩大器官〔2～4〕。因此，积极探索脑卒中的发病机制，降低脑卒中的发病率是当前医学研究的重点和前沿。研究发现缺血性脑卒中患者机体细胞可表现为能量代谢障碍、细胞内钙离子超载、活性氧(ROS)的生成、氧化应激及细胞凋亡等〔5〕。能量代谢中的关键蛋白表现出对缺血性神经重要的保护作用，虽然它们的机制还不甚明确，需要进一步探索。蛋白磷酸酶(PP)4是PP2A家族的重要成员之一，是调节糖和脂质代谢的新因子〔6〕；PP4基因也被证明参与了许多重要的细胞过程的调控〔7〕；作为位于中心体的蛋白，PP4参与中心体的成熟和微管的生长〔8〕；PP4还通过去磷酸化复制蛋白(RP)A2和组蛋白家族成员(H2A)X参与DNA损伤修复〔9,10〕。

然而，考虑到缺血性脑卒中能量代谢的关系，很少有研究探讨PP4在缺血性脑卒中最常受影响的肝和脑组织中的作用。本研究通过线栓法建立大鼠缺血性脑卒中模型，进一步探讨在缺血性脑卒中大鼠模型中肝组织和脑组织中PP4的表达水平，为PP4参与缺血性脑卒中提供线索。

1 材料和方法

1.1实验材料

1.1.1动物分组 45只健康雄性SD大鼠(体重：250～280 g),购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场(许可证号：3201111979),随机将SD大鼠分为正常(NORMAL)组、假手术(SHAM)组、大脑中动脉阻塞(MCAO)组，每组15只，MCAO组再分为MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组3个亚组，每个亚组5只。

1.1.2主要仪器和试剂 OLYMPUS立体显微镜，荧光定量PCR仪(LightCycler 480Ⅱ)，数显电子恒温水浴锅(常州国华电器有限公司，编号：0004)，超微量核酸蛋白浓度测定仪(Nanodrop2000C)，全景组织定量分析系统(TG：ZEISS Axio Imager Z2)，化学发光凝胶成像仪(AI600QC)，SYBR Green(Roche)，Trizol(TaKaRa)，蛋白酶抑制剂PMSF(BOSTER)，RNA反转录试剂盒(TransGen)，PP4调节亚基(PP4R)2抗体(ab70631)和PPX抗体(ab16475)购自Abcam，PP4催化亚基(PP4C)和内参β-actin引物(上海生工有限公司合成)，线栓(购于北京西农科技有限公司，型号：2436-A5)

1.2实验方法

1.2.1大鼠造模 术前1 d禁食不禁水，用Nagasawa等〔11〕的改良线栓法制成MCAO模型，用5%的戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠,仰卧固定；在显微镜下分离右侧颈总动脉、迷走神经、颈内动脉，结扎颈总动脉，在颈总动脉处挂线；用动脉夹夹闭颈内动脉远心端后,距动脉分叉4 mm剪一斜行切口,将线栓由颈总动脉插入颈内动脉,取下动脉夹，插入深度(18.5±0.5)mm,稍遇阻力感即停；固定线栓，剪断栓尾，缝合皮肤，碘伏消毒，术中及术后注意保暖。SHAM组只分离血管和神经。

1.2.2神经功能损伤评分 参考Longa等〔12〕的4级评分法在大鼠清醒后进行神经功能损伤评分。0分:无神经损伤症状；1分:不能伸展对侧前爪；2分：向一侧转圈追尾；3分:向对侧倾倒；4分:不能自发行走,意识丧失。1～3分纳入研究，0分和4分予以排除。

1.2.3切片制作及尼氏染色方法 各组大鼠在预定时间点麻醉处死,迅速断头取脑,在-20℃冷冻30 min,置脑模具中由额极到枕极切成2 mm厚的冠状切片,放于4%多聚甲醛中固定,常规脱蜡水化后将切片浸入1%甲苯胺蓝溶液染色6 min，蒸馏水浸5 min去除浮色，依次放入70%乙醇2 min，95% 乙醇5 min，100%乙醇浸泡 3 min；然后用透明剂(二甲苯)透明2次，5 min/次，中性树胶封片。每只大鼠随机选择2张经尼氏染色的大脑切片进行观察。将切片置于20倍全景组织定量分析系统显微镜下观察各组大鼠海马神经元细胞尼氏小体的染色情况，观察其病理改变。

1.2.4各组大鼠脑组织及肝组织中PP4 mRNA水平检测 取各组-80℃保存的大鼠脑组织和肝组织标本约0.2 g，液氮快速研磨，并根据Trizol法提组织RNA；测浓度及纯度，取1.5 μg总RNA反转录成cDNA；将逆转录产物稀释5倍，取2 μl作为模板进行qPCR。PP4C上游引物：5′-TGGCTGACTATTTCCTGTGAC-3′，下游引物：5′-CAACCTCTCCAGAGCAAGTC-3′，内参β-actin上游引物:5′-CACTTTCTACAATGAGCTGCG-3′，下游引物:5′-CTGGATGGCTACGTACATGG-3′。以灭菌纯水为无模板对照，使用不经逆转录的总RNA作为模板检测基因组DNA污染。qPCR 数值分析采用2-ΔΔCt分析法,利用Graph pad8.0作图。

1.2.5各组大鼠脑组织及肝组织中PP4 蛋白水平检测 取100 mg -80℃保存的脑组织，液氮充分研磨后加入0.5 ml RIPA(含PMSF)充分裂解组织提取蛋白，用Bradford法测浓度。各组取相同量总蛋白，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含5%脱脂牛奶的PBST溶液封闭 PVDF 膜，山羊抗小鼠PP4抗体(1∶1 000)与封闭的PVDF膜室温孵2 h，PBST 洗膜，二抗(1∶5 000) 室温孵育PVDF膜2 h，PBST洗膜，最后采用电化学发光(ECL)法进行显色。利用图像处理软件Image J对蛋白电泳图进行灰度分析，并以目的蛋白和内参蛋白的比值作为目的蛋白的相对定量值。

1.3统计学方法 采用SPSS24.0软件进行t检验、单因素方差分析、χ2检验。

2 结 果

2.1各组大鼠神经功能评分分析 MCAO组〔MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组神经功能损伤评分分别为：(1.145±0.363 6)分、(2.170±0.574 5)分、(2.950±0.463 0)分〕动物出现明显的神经功能缺损症状,主要表现为活动减少、精神萎靡、行走时向左侧倾倒或是不停地转圈追尾，MCAO-6 h组、MCAO-12 h组神经功能损伤评分显著高于MCAO-2 h组(P<0.01，n=5)。NORMAL组及SHAM组动物肢体活动自如,无神经功能损伤症状。

2.2各组脑组织形态学分析 尼氏染色显示,NORMAL组及SHAM组神经细胞未见明显异常，MCAO组梗死区尼氏小体数量减少，随时间延长，尼氏小体数量递减，见图1。

图1 各组脑组织尼氏染色(×20)

2.3肝、脑组织中PP4 mRNA水平分析 MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组脑组织PP4C mRNA水平较NORMAL组显著降低(P<0.05,P<0.001)；MCAO-2 h组肝组织PP4C mRNA水平较NORMAL组显著升高(P<0.001)；MCAO-6 h组、MCAO-12 h组肝组织PP4C mRNA水平与NORMAL组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4脑卒中肝、脑组织中PP4蛋白的表达 MCAO-2 h、MCAO-6 h组脑肝组织PP4R2蛋白水平较NORMAL组显著降低(P<0.001,P<0.01)；MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组肝组织PP4R2蛋白水平较NORMAL组显著升高(P<0.01)；除MCAO-12 h组肝组织PPX蛋白水平较NORMAL组显著降低(P<0.01)外，各组脑组织、肝组织PPX蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

1～4：NORMAL组、MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组图2 PP4R2和 PPX蛋白在大鼠脑、肝组织中的表达

3 讨 论

缺血性脑卒中与其他缺血性疾病类似，其发病过程是一个多步骤、多途径、多阶段相互作用和相互影响的复杂过程，这是导致该病治疗困难，致残率高、复发率高的重要原因〔13〕。研究表明，其致病机制极为复杂，脑缺血过程中，能量代谢障碍是脑缺血损伤的首要环节，而炎症和氧化应激损伤在脑缺血损伤过程中也扮演着重要的角色〔14,15〕。因此，从分子水平揭示缺血性脑卒中的发病机制，成为该病治疗的研究热点。

本研究从分子水平验证PP4在缺血性脑卒中脑、肝组织的表达是否存在差异。因为脑缺血损伤是一个复杂的病理级联反应，包括能量代谢紊乱、氧化应激、血脑屏障、炎症反应及炎症反应引起的细胞因黏附分子表达增加促进的炎症细胞浸润〔16〕。DNA双链断裂修复过程中会产生Ser-140位点磷酸化的H2AFX蛋白(γ-H2AFX)，而PP4C-PP4R2-PP4R3A PP4复合物可特异性使该位点脱磷酸，这是DNA修复的重要步骤。 研究表明，PP4作用的增加主要归因于PP4R2的增加，该亚基增强了磷酸IKKα/βS176/180与PP4C的缔合，导致磷酸化 IKKα/βS176/180〔17〕。本研究结果表明缺血性脑卒中大鼠机体内PP4 处于低表达状态，因为体内能量代谢紊乱和供能降低在多种神经病理性损伤中起重要作用，能量供应在有效治疗缺血性疾病中至关重要〔18〕。缺血性脑卒中导致脑部缺血缺氧，进而引起能量代谢降低，而脑部属于缺血性脑卒中直接影响部位，并且脑是机体中耗能最高的器官。本研究中MCAO-2 h组肝组织PP4C mRNA表达水平较NORMAL组高，6 h和12 h与NORMAL组无差异，可能与脑卒中患者血脂异常发生率较高，且总胆固醇增高明显有关〔19〕。随着总胆固醇增高，脂代谢增强，而肝脏是脂代谢的主要器官，因而在肝组织PP4表达增强；而6 h和12 h mRNA表达水平可能是随时间延长，肝脏通过代偿使PP4表达与NORMAL组一致〔20〕。肝组织蛋白水平和基因水平在6 h和12 h稍存在差异，可能是当机体发生急性缺血性脑卒中时，肝细胞缺血缺氧状态刺激机体快速将PP4C mRNA水平翻译成蛋白，短时间内提高了PP4C基因的翻译效率，但机体PP4C基因瞬时转录水平有限，不足以修复肝损伤区和缺血区肝细胞内大量已损伤DNA分子，尚无法逆转急性缺血性脑卒中的发生、发展〔21〕。

综上所述，在缺血性脑卒中发病前后的肝、脑组织中PP4的表达差异明显，而脑组织和肝脏呈现不同的表达变化模式，提示PP4与缺血性脑卒中存在一定关联性，并且脑卒中过程中PP4在脑组织和肝脏中的功能因组织种类而可能具有差异，为今后对缺血性脑卒中靶向用药和进一步研究提供了思路和方向。