肉桂游离酚提取物改善非酒精性肝细胞脂肪变性的活性研究

李会鹏　庞道睿　刘瑶瑶　邢东旭　钟赛意　黎尔纳　廖森泰　邹宇晓

摘要：【目的】分析云野肉桂中不同存在形式酚类物质的含量，并探究其不同存在形式酚类提取物对非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的影响，为热带亚热带植物肉桂资源的深加工及相关功能性食品的开发和利用提供理论依据。【方法】用福林酚法及硼氫化钠—四氯对苯醌法分析肉桂中不同存在形式的酚类物质及黄酮类物质的含量;体外以游离脂肪酸诱导剂（油酸钠∶棕榈酸=2∶1）诱导HepG2细胞为模型，分析不同浓度的肉桂游离酚/结合酚提取物对NAFLD细胞模型脂滴形成及甘油三酯（TG）含量的影响;体内以高脂饮食结合链脲佐菌素诱导的NAFLD小鼠为模型，探究体外筛选的强活性酚类提取物对小鼠血脂及肝脏中TG和游离脂肪酸含量的影响。【结果】肉桂多酚主要以游离酚（55.99±0.45 mg GAE/g）的形式存在，含有一定比例的结合酚（3.21±0.12 mg GAE/g），其中黄酮类物质（46.49±4.75 mg CE/g）是肉桂的主要酚类物质之一。云野肉桂游离酚提取物可有效降低NAFLD细胞模型胞内TG的水平。与模型组相比，经中和高剂量的肉桂游离酚提取物作用后，细胞内TG含量显著降低（P<0.05，下同），分别降低17.07%和26.83%，而结合酚提取物作用后细胞内TG水平与模型组相比无显著差异（P>0.05）。动物试验结果表明，高剂量的游离酚提取物干预后，不仅可以显著降低小鼠血清中TG、胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量，还能显著降低小鼠肝脏中TG和游离脂肪酸含量，分别降低42.21%和22.22%。液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析结果表明，肉桂游离酚提取物主要由原花青素C1、原花青素B2、原花青素A2、原花青素B3和原花青素B1等物质组成。【结论】肉桂游离酚提取物对NAFLD可能具有较好的改善作用，且原花青素类物质可能是发挥改善肝细胞脂肪变性作用的主要物质基础。

关键词： 肉桂提取物;多酚;脂肪变性;NAFLD细胞模型;小鼠

中图分类号： S567.12                              文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）03-0879-12

Effects of Cinnamon cassia free phenolic extract on nonalcoholic hepatocyte steatosis

LI Hui-peng PANG Dao-rui LIU Yao-yao XING Dong-xu

ZHONG Sai-yi LI Er-na LIAO Sen-tai ZOU Yu-xiao

（1College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong  524088， China; 2Sericultural & Agri-Food Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory

of Functional Food， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing/Maoming Branch， Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture， Guangzhou，

Guangdong  510610， China）

Abstract：【Objective】The contents of different forms of phenols of Cinnamon cassia and the effects of different forms of phenolic extracts on non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD） were studied in order to provide a theoretical basis for the processing of cinnamon resources and the development of functional foods of cinnamon. 【Method】The contents of phenols and flavonoids in cinnamon were analyzed by the Folin phenol method and the sodium borohydride/chloranil based assay（SBC），respectively. HepG2 cells induced by sodium oleate and palmitic acid （2∶1） were used as an in vitro model to analyze the regulation effects of different concentrations of free or bound phenolic extracts of C. cassia on the formation of intracellular lipid droplets. The change of triglyceride（TG） content of different groups was also determined. Compared with the bound phenolic extract，the free polyphenol extract of cinnamon showed a better effect on steatosis. Furthermore，mice fed on a high sugar and high fat diet in combination with streptozotocin（STZ） was used as to model the in vivo effects of the phenolic extracts on serum and liver lipids. 【Result】The results suggested that polyphenols（55.99±0.45 mg GAE/g） existed in cinnamon extracts mainly in free form. Notably，some bound polyphenols（3.21±0.12 mg GAE/g） were also detected. The flavonoids（46.49±4.75 mg CE/g） were the main component of cinnamon polyphenols. The free phenolic extract of the Yunye cultivar of cinnamon can effectively reduce the TG level in vitro. The extracts of medium and high dose groups significantly decreased the TG level by 17.07% and 26.83% relative to that of the model group，respectively（P<0.05，the same below）. There was no significant difference in intracellular TG level between the model group and the bound phenol extract group（P>0.05）. The results of animal experiments showed that the contents of TG，total cholesterol（TC） and low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C） in the serum of mice decreased significantly after the intervention of high dose free phenol extract. High dose cinnamon free phenol extract also significantly reduced the contents of TG and FFA in the liver of mice，which decreased by 42.21% and 22.22%，respectively. The results of LC-MS/MS showed that procyanidins C1，B2，A2，B3 and B1 may be the main flavonoid compounds of the cinnamon free phenolic extract. 【Conclusion】These results reveal that cinnamon free phenolic extract may have a good effect on NAFLD，and procyanidins may be the main compounds effective against the steatosis of liver cells.

Key words： cinnamon extract; polyphenols; hepatocyte steatosis; cell model of NAFLD; mice

Foundation items： Guangdong Key Field Research and Development Plan Project （2020B020225005）; Innovative Research Team Construction Project for Modern Agricultural Industry Common Key Technologies of Guangdong （2020KJ117）; Emerging Discipline Team Construction Project of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（202119TD）; Independent Research and Development Projects of Maoming Laboratory（2021ZZ004）

0 引言

【研究意义】非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确的肝损伤因素所致的肝细胞内脂肪沉积的临床病理综合症（中华医学会内分泌学分会，2018）。NAFLD在我国的患病率高达25%，已成为我国第一大慢性肝病且患病年龄逐渐趋于年轻化（Do and Lim，2016）。由于相关西药的副作用较多，植物中具有降脂活性的天然产物逐渐受到人们的关注。肉桂是樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥树皮（侯小涛等，2018），是我国卫生健康委员会认定的药食两用植物资源。肉桂原产于斯里兰卡，在我国主要分布于广西、广东、福建、台湾等南方地区。我国虽然是世界上肉桂最大的出口国，但多局限于肉桂皮原料和肉桂油粗品的直接出口，不仅缺乏深加工，还造成优质资源的严重浪费。肉桂多酚具有抗氧化（Qin et al.，2014）、调节糖脂代谢（姜琼等，2013;Afrose et al.，2019）的生物活性，且多酚的存在形式可能会影响其生物活性。因此，探究肉桂不同存在形式的酚类提取物对肝细胞脂肪变性的影响，对其资源的开发和高效利用具有重要意義。【前人研究进展】NAFLD一般通过管理生活方式、手术治疗及服用药物等方式缓解。研究者主要从胰岛素抵抗、肝细胞凋亡和炎症反应等关键环节进行药物开发（迟骁玮，2021）。但有些药物具有明显的副作用，如引发腹胀和便秘等不良症状（陶琦等，2021）。肉桂中已鉴定出的多酚主要为类黄酮类及其多聚体化合物，包括儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、原花青素类、缩合单宁和阿魏酸等（胡少平，2014）。现国内外对肉桂的研究主要集中在肉桂提取物的药理作用上，且取得了一定的成果。Shafiee-Nick等（2012）发现含有肉桂皮的中草药混合物可改善糖尿病大鼠高血糖症，降低血脂和天门冬氨酸氨基转移酶的活性。Lopes等（2015）探讨了长期补充肉桂水提物对小鼠脂质代谢的影响，发现肉桂水提物可减少小鼠体重和脂肪储存量，有助于预防或延缓脂质紊乱。Tulini等（2016）将富含原花青素的肉桂提取物包埋到固体脂质微粒中，改善了其稳定性差、味道不好等缺点，有望扩大其在食品领域中的应用。钟益宁等（2020）采用湿法制粒技术，研制了能发挥降糖作用的肉桂降糖口含片。目前，含肉桂多酚的功能性食品开发正处于起步阶段，其市场具有广阔的前景。【本研究切入点】天然产物来源丰富且安全性相对较高，部分天然活性物质表现出降脂效果，因此从天然产物中寻找降脂活性成分是目前的前沿研究领域之一。然而，前人对肉桂酚类物质的分析多以游离态多酚含量作为总多酚，往往忽视对不同存在形式酚类物质的分析。此外，肉桂不同存在形式的酚类物质调节肝细胞脂质代谢的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】以华南地区较为广泛种植的云野肉桂为原料，分析其不同存在形式的多酚和黄酮含量，并探究游离态和结合态多酚提取物对NAFLD细胞模型脂肪变性的影响，筛选出较强活性的酚类提取物在体内试验中进行验证，为肉桂资源的开发和深入利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

云野肉桂由广西林业科学院经济林研究所提供，50 ℃烘干后，粉碎过40目筛保存。软脂酸、油酸钠、洛伐他汀和链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）购自上海凛恩科技发展有限公司;HepG2细胞购自中国科学院上海细胞库;油红O染色试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司;甘油三脂（Triglyceride，TG）、胆固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游离脂肪酸（Free fatty acids，FFA）和总蛋白定量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;苏木素伊红染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;二甲双胍购自中美上海施贵宝制药有限公司;氢氧化钠、无水碳酸钠和二甲苯等均为分析纯。

主要仪器设备：UV-1800型紫外—可见分光光度计（日本岛津有限公司）;RW 20 digital均质机（广州市深华生物技术有限公司）;N-1300型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）;LDZX-50L型高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）;SW-CJ-1FD型细胞超净台（苏州净化设备有限公司）;THERMO FORMA 370细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）;DMI 4000B光学显微镜（德国Leica微系统有限公司）;SYNERGY H1全功能酶标仪（美国Biotek公司）;YD-AB摊片烤片一体机（金华市益迪医疗设备有限公司）;HWS26电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）;SCIEX Q-Trap 6500+（美国SCIEX公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 肉桂游离酚提取物制备 肉桂游离酚提取物的制备参考Pang等（2017）的方法，并稍作改动。称取肉桂粉10 g，按料液比1∶30（w/v）加入70%乙醇，70 KHz下超声提取0.5 h，4 ℃下离心（4500 r/min，10 min）;收集上清液，残渣重复提取2次，合并上清液;45 ℃旋转蒸发并定容至25.0 mL，贮存于冰箱备用。

1. 2. 2 肉桂结合酚提取物制备 肉桂结合酚提取物的制备参考Adom和Liu（2002）的方法。向1.2.1得到的肉桂残渣中加入4 mol/L NaOH溶液15.0 mL，消化振荡90 min，然后用盐酸调pH至2.0，并用适量的乙酸乙酯萃取5次;将萃取液合并，45 ℃旋转蒸发至干，定容至10.0 mL后，贮存于冰箱备用。

1. 2. 3 肉桂游离酚/结合酚提取物中酚类物质含量测定 酚类物质含量采用福林酚法（谢利华，2018）进行测定，以没食子酸为标准品。吸取0.5 mL肉桂游离酚/结合酚提取物稀释液，加入2.0 mL去离子水和0.5 mL福林酚试剂后，混匀静置;再加入5.0 mL 7%碳酸钠溶液和4.0 mL去离子水，混匀，室温放置90 min，测定OD。酚类物质含量以mg没食子酸（GAE）/g表示，以干重计。

1. 2. 4 肉桂游离酚/结合酚提取物中黄酮类物质含量测定 黄酮类物质含量采用硼氢化钠—四氯对苯醌法（庞道睿，2018）进行测定，以儿茶素为标准品。取1.0 mL样品稀释液，氮气吹干后用乙醇—四氢呋喃（1∶1，v/v）复溶;分别加入0.5 mL 50 mmol/L NaBH4溶液和0.5 mL 74.6 mmol/L AlCl3溶液，室温反应30 min，再加入0.5 mL 50 mmol/L NaBH4溶液，室温反应30 min;加入2.0 mL 8 mmol/L冰醋酸溶液，避光且室温反应15 min;加入1.0 mL 20 mmol/L四氯对醌溶液，油浴1 h，冷却后用甲醇定容至4.0 mL，再分别加入1.0 mL 16%香草醛甲醇溶液和2.0 mL浓盐酸，混匀后暗反应15 min，离心，取上清液测OD。其含量以mg儿茶素（CE）/g表示，以干重计。

1. 2. 5 NAFLD细胞模型建立 NAFLD細胞模型的建立参考殷锦锦等（2014）的方法，稍作改动。采用油酸钠和棕榈酸（2∶1）诱导建立NAFLD细胞模型。将HepG2细胞以每孔4×10接种于96孔板中，进行24 h贴壁培养，然后更换含有0.4 mmol/L FFA诱导剂的DMEM培养基，诱导造模24 h。

1. 2. 6 肉桂游离酚/结合酚提取物对NAFLD细胞模型的影响 先通过CCK-8试剂盒测定肉桂游离酚/结合酚提取物对细胞存活率的影响，确定本研究使用样品的浓度。将HepG2细胞以每孔4×104接种于96孔板中，在培养箱中培养24 h，更换含有不同浓度肉桂酚类提取物和0.4 mmol/L FFA诱导剂的DMEM培养基，作用24 h，PBS清洗3次。具体分组如下：空白组：含1% BSA的DMEM培养基培养;模型组：含0.4 mmol/L FFA的DMEM培养基培养;阳性对照组：含5 µmol/L洛伐他汀和0.4 mmol/L FFA诱导剂DMEM培养基培养;试验组：含有不同浓度肉桂游离酚提取物（0.08、0.16、0.32 mg/mL）或肉桂结合酚提取物（1.5、3.0、6.0 mg/mL）和0.4 mmol/L FFA的DMEM培养基培养。油红O染色后用显微镜观察细胞内红色脂滴的形成情况，并测定细胞中TG含量。

1. 2. 7 NAFLD小鼠模型建立 试验动物采用SPF级BALB/c小鼠（4周龄，雄性，体重18～22 g），购自南方医科大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（粤）2016-0041。采用高脂饲料结合STZ造模。模型组饲喂高脂饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，TP23520）满2周后，注射100 mg/（kg·bw）STZ辅助造模，并继续饲喂4周。眼眶采血检测各组小鼠血清TG和TC含量，若与正常组相比，模型组二者含量显著升高（P<0.05，下同），则模型建立成功（李思锦等，2022）。试验期间所有操作均严格按照中国实验动物的相关饲养规范和法律规定进行。

1. 2. 8 肉桂游离酚提取物对NAFLD小鼠的降脂活性评价 在进行动物试验之前，按1.2.1的提取方法制备灌胃所需的肉桂游离酚提取物。将肉桂游离酚提取物上清液离心、浓缩、真空冷冻干燥后，保存于-20 ℃冰箱备用。小鼠的灌胃剂量根据体表面积使用以下公式计算（闫俐维等，2021）：

小鼠的剂量（mg/kg）=人的剂量（mg/kg）×12.33

结合Gruenwald等（2010）、Taheri等（2018）的研究结果，进一步设置本研究肉桂游离酚提取物的灌胃剂量分别为1、4和8 g/（kg·bw），以鲜重计。

造模成功后，进一步研究肉桂游离酚提取物对小鼠的降脂活性。按每组6只进行分组（表1）。肉桂游离酚提取物灌胃干预4周后，禁食12 h，麻醉后取血，按照试剂盒的方法检测小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C含量。解剖取肝脏，用于分析肝脏指标。取100 mg肝脏组织用甲醇∶氯仿（1∶2，v/v）溶液进行匀浆，振荡提取60 min并用氮气吹干，再用适量的异丙醇重新溶解（Wang et al.，2014）。离心取上清液，用于小鼠肝脏TG和FFA含量的测定。

1. 2. 9 肉桂游离酚提取物组成成分分析 采用液相色谱串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法检测肉桂游离酚提取物的化学组成成分。称取50 mg肉桂游离酚提取物冻干粉，溶解于500 μL提取液中。离心（12000 r/min，10 min），取上清液，重复提取1次;上清液过滤膜后，保存于进样瓶中。

液相条件：色谱柱为ACQUITY BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流速0.35 mL/min;柱温40 ℃;进样量2 μL;流动相：A为甲醇，B为超纯水（加入0.1%甲酸）;梯度洗脱：A溶剂的程序为0～6 min：95%～50%，7～12 min：50%～5%，12～14 min：5%～5%，14～16 min：5%～95%，二极管阵列紫外检测器全波长扫描，紫外检测器流出液不经分流直接导入质谱系统检测。

质谱条件：采用ESI源，正离子模式下质谱电压5500 V，离子扫描范围100～800 m/z，温度550 ℃，气帘气35 psi。

1. 2. 10 肝脏组织病理学检测 小鼠肝脏经4%甲醛固定后，用梯度酒精进行脱水，然后石蜡包埋切片。HE染色后，参照姚笑睿（2017）的方法对切片进行组织病理学分析。

1. 3 统计分析

数据结果均以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 24.0进行方差分析（ANOVA），Duncan’s多重比较方法进行显著性方差分析，以GraphPad Prism 9.0制图。

2 结果与分析

2. 1 肉桂酚类提取物中多酚和黄酮含量分析结果

云野肉桂酚类提取物中多酚和黄酮含量测定结果如图1所示。由图1-A可知，云野肉桂游離酚含量（55.99±0.45 mg GAE/g）显著高于结合酚含量（P<0.05，下同），而与总酚含量（59.20±0.28 mg GAE/g）之间无显著差异（P>0.05，下同）。因此，肉桂多酚主要以游离酚的形式存在。由图1-B可知，游离黄酮含量（42.57±3.20 mg CE/g）显著高于结合黄酮含量，而与总黄酮含量（46.49±4.75 mg CE/g）之间无显著差异。参考Wang等（2013）的方法，基于酚类物质标准品没食子酸和黄酮类物质标准品儿茶素的摩尔质量，计算出游离黄酮对游离酚的贡献率为44.86%，总黄酮对总酚的贡献率为46.50%。由此可知，肉桂黄酮主要以游离黄酮的形式存在，黄酮类物质是肉桂的主要酚类物质之一。

2. 2 肉桂酚类提取物对NAFLD细胞模型的影响

2. 2. 1 游离酚提取物对NAFLD细胞模型的影响

通过CCK-8试剂盒测定肉桂游离酚提取物对细胞存活率的影响，当提取物浓度为0.04～0.32 mg/mL时，对细胞无明显毒性作用。因此，选择浓度小于0.32 mg/mL提取物开展后续试验。油红O染色结果如图2所示，与空白组相比，模型组内红色脂滴积聚明显，由此可知积累了大量的脂质;而不同浓度的肉桂游离酚提取物作用后，一定程度减少了细胞内的红色脂滴含量。

肉桂游离酚提取物作用后细胞内TG含量如图3所示。与空白组比较，模型组细胞内的TG含量显著升高;与模型组相比，肉桂游离酚提取物低剂量组TG含量降低3.66%，但差异不显著，中剂量组TG含量显著降低17.07%，高剂量组TG含量显著降低26.83%，但高剂量组TG含量与空白组间差异不显著。

2. 2. 2 结合酚提取物对NAFLD细胞模型的影响

通过CCK-8试剂盒测定肉桂结合酚提取物对细胞存活率的影响，当提取物浓度为0.78～6.25 mg/mL时，对细胞无明显毒性作用。因此，选择浓度小于6.25 mg/mL肉桂结合酚提取物开展后续试验。油红O染色结果如图4所示，空白组视野内有少量的红色脂滴，而模型组积累了大量的脂质且积聚明显;肉桂结合酚提取物作用后，细胞内的红色脂滴未得到明显改善，仍然积聚明显。

肉桂结合酚提取物作用后细胞内TG含量如图5所示。与空白组比较，模型组细胞内的TG含量显著升高;经肉桂结合酚提取物低、中和高剂量作用后，与模型组相比，细胞内的TG含量差异不显著。以上结果表明，结合酚提取物处理后，未显著降低HepG2细胞内的TG含量。

2. 3 NAFLD小鼠模型的建立

造模成功后，模型组小鼠（图6-B）与正常组小鼠（图6-A）相比，毛发杂乱，且摄食、饮水和排泄量明显增加。与正常组小鼠体重（27.72±0.75 g）相比，模型组小鼠体重明显增加，为31.03±1.55 g;模型组小鼠肝脏的重量为2.18±0.42 g，与正常组小鼠（1.33±0.20 g）相比，也有明显增加。肝脏组织病理学检测结果表明，与正常组小鼠（图6-C）相比，模型组小鼠（图6-D）肝细胞排列紊乱，发生了严重的脂肪样变性和空泡变性。表明NAFLD小鼠模型建立成功。

2. 4 肉桂游离酚提取物对小鼠血脂水平的影响

基于体外试验结果，分析肉桂游离酚提取物对模型小鼠血脂的影响（表2）。经游离酚提取物干预后，小鼠血清中TG含量与模型组相比显著降低;分析各组小鼠TC含量发现，经中剂量和高剂量的游离酚提取物灌胃干预后，小鼠血清中TC含量较模型组小鼠分别显著降低10.39%和25.96%;与模型组小鼠相比，低剂量组小鼠血清中LDL-C含量无显著差异，而中剂量组和高剂量组血清中LDL-C含量显著降低;游离酚提取物干预后，小鼠血清中HDL-C含量升高，但与模型组相比差异不显著。因此，肉桂游离酚提取物可降低模型小鼠的TG、TC和LDL-C含量，提高HDL-C含量。

2. 5 肝脏组织病理学检测结果

肝脏组织病理学检测结果如图7所示。正常组小鼠肝细胞大小一致、排列均匀，肝索排列清晰（图7-A）;模型组小鼠肝细胞肿胀，发生严重的脂肪样变性和空泡变性，排列不规则，肝索杂乱（图7-B）;阳性药物组小鼠肝细胞排列较紧密，空泡变性程度得到改善（图7-C）。经不同浓度的肉桂游离酚提取物作用后，肝细胞变性程度也得到不同程度缓解;肉桂游离酚提取物低剂量组小鼠肝细胞排列不规则，细胞发生严重的炎性细胞浸润，且空泡变性的现象较多（图7-D）;中剂量组小鼠肝细胞大小基本一致，排列较规则，部分区域仍存在空泡变性现象（图7-E）;高剂量组小鼠肝细胞排列较整齐，炎性细胞的浸润程度降低，空泡变性细胞明显减少（图7-F）。因此，肉桂游离酚提取物可能对小鼠脂肪肝有明显的缓解作用。

2. 6 肉桂游离酚提取物对小鼠肝脏脂代谢的影响

由图8-A可知，与空白组小鼠肝脏TG含量（1.54±0.35 mmol/gprot）相比，模型组小鼠的含量（3.08±0.64 mmol/gprot）显著升高，阳性对照组小鼠肝脏中TG含量与空白组差异不显著;不同剂量的肉桂游离酚提取物灌胃干预后，各剂量组小鼠肝脏中TG含量均显著低于模型组小鼠肝脏TG含量。低剂量组小鼠肝脏TG含量为2.03±0.22 mmol/gprot，与模型组小鼠相比降低34.09%;中剂量组和高剂量组小鼠肝脏TG含量分别为2.00±0.09和1.78±0.54 mmol/gprot，较模型组小鼠分别降低35.06%和42.21%。由图8-B可知，模型组小鼠肝脏FFA含量（0.45±0.05 mmol/gprot）显著高于空白组小鼠，是正常组小鼠肝脏FFA含量的1.36倍;经不同剂量的肉桂游离酚提取物灌胃干预后，各剂量组小鼠肝脏中FFA含量表现出不同程度的降低。其中，中剂量组和高剂量组肝脏中FFA含量与模型组相比，分别显著降低17.78%和22.22%。

2. 7 肉桂游离酚提取物成分分析结果

肉桂游离酚提取物经LC-MS/MS分析后，共鉴定出28种化合物，主要由原花青素类和糖苷类物质组成（表3）。原花青素主要包括原花青素C1、原花青素B2、原花青素A2、原花青素B3和原花青素B1，其中，原花青素C1含量最高（5384.02±818.06 μg/g），原花青素B2含量（3110.15±474.26 μg/g）次之，原花青素B1含量在原花青素類中最少，为120.24±22.32 μg/g。此外，糖苷类物质种类丰富，含量介于0.02±0.00～7.45±1.00 μg/g。具体物质的定性和定量分析见表3。

3 讨论

肉桂含有丰富的多酚类物质，其总酚含量为59.20±0.28 mg GAE/g，明显高于富含多酚的常规水果（Sun et al.，2002）。植物多酚主要以游离态和结合态的形式存在。游离酚易于提取，可在人体内消化吸收;而结合酚通常以共价键形式（酯键、醚键和碳—碳键）结合在植物细胞壁结构物质上（张浩，2021），其可在胃肠道内因酶水解而释放，经机体吸收和代谢发挥健康益处。有研究表明结合酚经机体肠道菌群发酵后可能比游离酚具有更强的生物活性（Acosta-Estrada et al.，2014）。若只对游离酚进行研究而忽略结合态多酚的存在，会低估植物原料中多酚化合物的营养健康效应。本研究通过碱水解方式，破坏相关的共价键来提取肉桂中的结合酚，结果表明，肉桂多酚主要以游离酚的形式存在，也存在一定比例的结合酚（3.21±0.12 mg GAE/g）。此外，本研究中检测到肉桂中总黄酮含量为46.49±4.75 mg CE/g，与前人研究结果（林款等，2019）存在一定差异，可能与检测方法有一定关系，本研究中所用的SBC法可检测包括黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷醇和花青素等更多的黄酮类物质，故本研究的测定结果可能较前人测定结果更准确。

大量研究证实多酚是重要的活性成分，可能具有调节脂代谢的作用（Park et al.，2013;Rafiei et al.，2018）。为探究肉桂酚类提取物对肝脏脂肪变性的调节作用，本研究在体外建立NAFLD细胞模型分析肉桂酚类提取物改善NAFLD的活性。国内外的研究表明，可利用游离脂肪酸诱导HepG2细胞脂肪变性构建体外模型。张玉龙（2021）、Hsu等（2021）分别以0.5 mmol/L油酸或0.3 mmol/L棕榈酸诱导HepG2细胞建立NAFLD模型，研究鸭油和黄瓜多酚水提物对脂质代谢的影响。然而，饱和脂肪酸（棕榈酸）和不饱和脂肪酸（油酸）均是人们日常饮食中摄入的常见长链脂肪酸。由于摄入饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的过量或失衡会导致NAFLD的发生，且刘萌等（2016）研究发现油酸和棕榈酸（2∶1）对HepG2细胞毒性较小，诱导后更符合人体脂肪变性的病理过程，因此，本研究利用0.4 mmol/L FAA诱导剂（油酸钠∶棕榈酸=2∶1）造模，并运用此模型进行肉桂酚类提取物改善脂质代谢的研究。

肉桂游离酚提取物中含有多种形式的原花青素类和糖苷类物质，还有少量的芦丁等物质存在。目前，已有研究证明上述化合物具有调节脂质代谢的作用（Tie et al.，2020;Qin et al.，2021）。原花青素对脂肪酶具有明显的抑制作用，且聚合度越高，抑制作用越强（周培羽等，2019）;其可能通过调节Wnt3a/β-catenin信号通路，显著降低体内白色脂肪含量，抑制脂肪沉积（顾艾鑫等，2021）。原花青素B2可能通过调节肠道菌群结构以及脂肪酸代谢、胆汁酸代谢等多个代谢途径，显著改善高血脂模型小鼠的血脂代谢异常和氧化应激（吴其国，2019）。此外，异槲皮苷可改善NAFLD大鼠模型肝脏或肝细胞脂质积聚，减轻炎症和氧化应激（Qin et al.，2018）。芦丁可减少3T3-L1前脂肪细胞中脂滴的生成，改善细胞内脂质堆积（徐红敏和吴惠文，2021），还可降低T2DM大鼠的血糖和血脂，改善其糖脂代谢紊乱（苗建红等，2014）。因此，肉桂中存在的多种黄酮类物质可能对机体脂代谢有明显的调节作用。经定性和定量分析后，发现肉桂游离酚提取物中含有的原花青素C1、原花青素B2、原花青素A2、原花青素B3和原花青素B1均明显高于其余23种黄酮类化合物。因此，原花青素类物质可能是改善肝脏细胞脂肪变性的主要物质基础。本研究中结合酚并未表现出较强的生物活性，推测可能是与该存在形式多酚物质的含量较低有关。

已有研究证明油脂是脂肪肝的重要危险因素，摄入过多的油脂能促进脂肪肝的发生和发展（魏颖等，2014）。TG是FFA和甘油形成的脂肪分子，在体内含量最高;TG合成所需的FFA主要来源于血清和糖代谢（廖海林和肖新华，2014）。高脂饲料中的油脂经机体吸收后，会升高血清中的FFA和TC含量。这为小鼠肝脏的TG合成和TC积累提供了大量原料。本研究结果表明，中剂量和高剂量的肉桂游离酚提取物干预后，肝脏的TG和FFA含量显著降低。这可能与肉桂游离酚提取物抑制肠道油脂的吸收转化，降低血清和肝脏中FFA含量，从而降低肝脏合成TG有关。此外，HDL可将TC从肝外细胞转运至肝脏，将其转化生成胆汁酸盐排出体外（王丽霞等，2013）。本研究中肉桂游离酚提取物干预后，血清中HDL-C含量升高。因此，肉桂游离酚提取物还可能通过加快TC的逆转运，降低血清中TC。但是其调节NAFLD小鼠脂代谢紊乱的信号传导机制仍需进一步研究。

4 结论

肉桂多酚主要以游离酚的形式存在，也存在一定比例的结合酚，且黄酮类物质是肉桂的主要酚类物质之一。肉桂游离酚提取物在体外具有改善NAFLD细胞模型脂肪变性的作用，而结合酚提取物的作用不明显。肉桂游离酚提取物不仅可以降低血脂水平，还能降低肝脏中TG和FFA含量，减少肝脏中脂质堆积，减轻肝细胞变性程度。因此，肉桂游离酚提取物对机体的肝脏脂肪变性可能起到改善作用，且原花青素类物质可能是改善肝脏细胞脂肪变性的主要活性物质。

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（責任编辑 罗 丽）