澳洲坚果果皮不同溶剂提取物的含量和抗氧化活性

林文秋+杨为海+邹明宏

摘要：以成熟的澳洲坚果为试验材料，分别选用水和体积分数70%甲醇、70%乙醇与70%丙酮4种溶剂对澳洲坚果的新鲜果皮进行浸提，测定各溶剂提取物的总酚、总黄酮与单宁含量及其抗氧化活性。结果表明，不同溶剂对澳洲坚果果皮中总酚、总黄酮与单宁含量以及DPPH、ABTS自由基清除能力与总抗氧化能力方面存在明显差异，以体积分数70%丙酮提取物的总酚、总黄酮与单宁含量最高，分别为（6.63±0.15） mg/g（FW）、（8.65±0.32） mg/g（FW）、（8.80±0.31） mg/g（FW）。其次是70%甲醇、70%乙醇；水提取物的含量最低。相关性分析表明，提取物中的总酚含量与其抗氧化能力显著相关。可见，提取剂的性质明显影响其提取物的酚类物质含量与抗氧化活性。

关键词：澳洲坚果果皮；溶剂提取物；多酚；黄酮；抗氧化活性

中图分类号： S667.901 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0171-04

澳洲坚果（Macadamia spp.）别称夏威夷果，原产于澳洲，属于山龙眼科（Proteaceae）澳洲坚果属（Macadamia F. Mull）常绿乔木果树，被誉为世界“干果之王”，以富含多种不饱和脂肪酸为主要特点，还含有蛋白质、矿质元素和维生素等，具有较高的营养价值和保健功效。 作为一种新兴的高档坚果类果品，澳洲坚果在国际市场上供不应求，具有广阔的市场前景。近年来，中国澳洲坚果产业得到迅猛发展，目前种植规模已达652 km2，年产带壳果约9 700 t[1]。

澳洲坚果果实主要由果皮、种壳和果仁组成，其初加工的主要副产物为约占果实鲜质量的1/2的果皮和约占带壳果干质量的2/3种壳。当前国内外对澳洲坚果果仁的营养成分[2-5]与保健价值[6-7]、种壳的功能性組分[8-10]及开发利用[11-13]等方面的研究报道较多，但对果皮内含物的研究仅见于不同种质果皮的粗蛋白、可溶性糖、单宁及矿质元素含量的测定与分析[14-15]，至今尚未见有果皮酚类物质及其抗氧化活性研究的报道。本试验采用水和体积分数70%甲醇、70%乙醇与70%丙酮4种溶剂浸提澳洲坚果果皮，研究不同溶剂提取物的总酚和总黄酮含量及其抗氧化活性的差异，旨在探讨适宜获得澳洲坚果果皮中天然抗氧化物质的提取溶剂，为开发和利用澳洲坚果果皮这一副产物资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试澳洲坚果果皮为已成熟的澳洲坚果新鲜果实，采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种质资源圃，分离出果皮，于-80 ℃冰箱中保存备用。

主要仪器有紫外可见分光光度计UV-1200，上海美谱达仪器有限公司；电子分析天平ML204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机Heraeus Multifuge X1R，德国Thermo Fisher Scientific公司。

主要试剂包括Folin-Cioealteu试剂、没食子酸、芸香苷、Trolox（水溶性维生素E类似物）、DPPH、ABTS、TPTZ，均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物制备 准确称取澳洲坚果果皮1.0 g，放入研钵中，液氮研磨成粉末，转移至15 mL离心管中，分别以体积分数为70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮和水，料液比为 1 g ∶10 mL，充分混匀后置于37 ℃水浴中浸提1 h，4 ℃ 离心（2 200 g）20 min，取上清备用。

1.2.2 总酚含量测定 总酚含量的测定采用改良Folin-Cioealteu 法[16]。取0.5 mL样品溶液与2.5 mL 10% Folin-Cioealteu反应液于15 mL试管中，充分混匀，避光孵育5 min后与2.0 mL 20% Na2CO3溶液充分混匀，30 ℃水浴避光反应1 h，于765 nm下测定吸光度，重复3次。以没食子酸标准品制作标准曲线计算总酚含量（mg/g，FW）。

1.2.3 总黄酮含量测定 总黄酮含量的测定参照Benamar等的方法[17]。取0.5 mL样品溶液与0.5 mL 5% NaNO2溶液于15 mL试管中，充分混匀，反应5 min后加入0.5 mL 10% AlCl3摇匀，静置6 min；再加入1.5 mL 1.0 mol/L NaOH，于40 ℃水浴中避光反应15 min后，于510 nm下测定吸光度，重复3次。以芸香苷标准品制作标准曲线计算总黄酮的含量（mg/g，FW）。

1.2.4 单宁含量的测定 单宁含量的测定参照等的方法。取2 mL样品溶液加入含有25 mL蒸馏水和2.5 Folin-Donis试剂的容量瓶中，加入1mol/L的碳酸钠溶液，剧烈振荡，于30 ℃恒温箱中放置1.5 h后，于680 nm下测定吸光度，重复3次。以单宁标样绘制标准曲线计算单宁含量（mg/g，FW）。

1.2.5 抗氧化活性测定 DPPH自由基清除能力的测定。参照Vieira等的方法[18]，利用60 mL甲醇和40 mL乙酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH值5.5）现配DPPH溶液（50 μmol/L）。取 2.9 mL DPPH溶液，于517 nm下测定其初始吸光度（D0）；取2.9 mL DPPH溶液和0.1 mL样品溶液充分混匀后，于 30 ℃ 水浴中避光反应15 min，测定其吸光度（D15）。以甲醇-乙酸钠缓冲液为空白调0，重复测定3次。样品的DPPH自由基清除率按[100%-（D15/D0）× 100%]计算，用Trolox为标准物制作标准曲线计算其抗氧化活性。

ABTS自由基清除能力的测定。参照Re等的方法[19]，将现配的ABTS反应液（7 mmol/L）用80%乙醇稀释至734 nm的吸光度为0.70±0.02，作为其初始吸光度（D0）；取0.1 mL样品溶液与2.9 mL稀释了的ABTS反应液混匀，于30 ℃水浴中避光反应7 min，测定其吸光度（D7）。以80%乙醇为空白调0，重复测定3次。样品的ABTS自由基清除率按[100%-（D7/D0）× 100%]计算，以Trolox为标准物制作标准曲线计算其抗氧化能力。

总抗氧化能力的测定。参照Benzie等的FRAP法[20]，将乙酸钠缓冲液（0.3 mol/L，pH值3.6）、TPTZ（10 mmol/L）与FeCl3·6H2（20 mmol/L）按体积比10 ∶1 ∶1现配FRAP试剂，取0.15 mL样品溶液和2.85 mL FRAP反应液混匀，于 37 ℃ 水浴中避光反应20 min后，于593 nm下测定其吸光度，重复测定3次。以FeSO4为标准物制作标准曲线计算其总抗氧化能力。

1.2.6 统计分析 用SPSS 17.0软件进行数据整理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 澳洲坚果果皮不同溶剂提取物的总酚、总黄酮与单宁含量

水和体积分数70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮为提取溶剂，测定澳洲坚果果皮的总酚（没食子酸等效物）、总黄酮（芸香苷等效物）和单宁（单宁酸等效物）的含量（表1）。由表1可知，不同溶剂提取的总酚、总黄酮、单宁含量均具有一定差异，其中体积分数为70%丙酮的提取效果最佳，其次是体积分数为70%的甲醇和70%的乙醇，水提取效果最差。70%丙酮提取液总酚含量（6.63 mg/g，FW）、总黄酮含量（8.65 mg/g，FW）、单宁含量（8.80 mg/g，FW）显著高于70%乙醇（4.70、4.45、5.18 mg/g，FW ）、70%甲醇（4.39、3.9、5.19 mg/g，FW）和水（2.28、2.74、2.31 mg/g，FW）。比较而言，体积分数70%丙酮提取液的总酚、总黄酮与单宁含量分别约是体积分数70%甲醇与70%乙醇提取液的1.5、2.0、1.7倍，说明对澳洲坚果果皮中的总酚、总黄酮与单宁这3种物质，体积分数为70%丙酮的提取效果最好。

2.2 澳洲坚果果皮不同溶剂提取物的抗氧化活性

2.2.1 总抗氧化能力FRAP FRAP法是一种快速简便、重复性好的测定总抗氧化能力的方法，待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力越大，其抗氧化活性越强。本研究是以Fe2+当量计算澳洲坚果果皮提取物的总抗氧化能力，结果见图1。图1表明，不同溶剂提取液的总抗氧化能力具有显著差异，总抗氧化能力大小排序为70%丙酮>70%乙醇>70%甲醇>水，总抗氧化能力依次为（191.43±6.72）、（109.86±6.33）、（100.58±7.27）、（62.54±0.98） μmol/g。其中，70%丙酮提取液的总抗氧化能力显著高于醇提取液和水。体积分数70%丙酮提取液的总抗氧化能力约是醇提取液的1.9倍和水提取液的3.1倍。

2.2.2 DPPH自由基清除能力差异 DPPH法常用于抗氧

化剂清除自由基能力的评价。本研究中，以标准抗氧化剂Trolox为等效物来衡量澳洲坚果果皮4种溶剂提取物的 DPPH 自由基清除能力，结果如图2所示。图2表明，不同溶剂提取液对DPPH自由基清除能力不同，其对DPPH自由基清除能力顺序为70%甲醇提取溶剂[（104.67±2.54） μmol/g，FW ]> 70%丙酮提取溶剂[（51.30±1.99） μmol/g，FW ]> 70%乙醇提取溶剂[（35.61±5.85） μmol/g，FW ]> 水[（34.19±0.40） μmol/g，FW]。4种溶剂中体积分数70%甲醇提取溶剂的DPPH自由基清除能力显著高于其他3种，而70%丙酮、70%乙醇和水3种溶剂的DPPH自由基清除能力差异不显著，说明70%甲醇是澳洲坚果DPPH自由基清除能力的最佳提取溶剂。

2.2.3 ABTS自由基清除作用 与DPPH自由基类似，ABTS+与抗氧化剂反应后溶液发生褪色，溶液褪色越明显，则表明所检测物质的抗氧化能力越强。本研究以Trolox为标准计算澳洲坚果果皮4种溶剂提取物的ABTS自由基清除能力，结果见图3。由图3可知，不同溶剂提取液对ABTS自由基的清除能力不同，其对ABTS自由基清除能力的强弱顺序依次为70%丙酮[（136.31±6.09） μmol/g，FW]>70%甲醇[（100.79±0.93） μmol/g，FW ]>70%乙醇[（81.13±3.35） μmol/g，FW]>水[（60.35±0.67） μmol/g，FW]。4种溶剂中，体积分数70%丙酮提取溶剂的ABTS自由基清除能力显著高于其他3种，70%甲醇、70%乙醇提取溶剂ABTS自由基清除能力差异不显著，说明70%丙酮是澳洲坚果ABTS自由基清除能力的最佳提取溶剂。

2.3 澳洲坚果果皮总酚含量与抗氧化能力的相关性分析

相关性分析（表2）表明，总酚含量与单宁含量呈极显著正相关（r=0.901），与总黄酮含量不相关，由此说明单宁类化合物是澳洲坚果果皮酚类物质的主要组成部分。此外，总酚与DPPH、ABTS、FRAP清除率呈极显著正相关，相关系数分别为0.901、0.978、0.921；单宁含量和DPPH、ABTS、FRAP清除率呈极显著正相关，相关系数分别为0.972、0.919、0.998；而总黄酮含量与DPPH、ABTS、FRAP清除率不相关，说明酚类物质在澳洲坚果果皮抗氧化能力方面发挥着重要作用。总酚含量和抗氧化活性测定的3个指标均有显著相关性，表明DPPH、ABTS、FRAP清除率均适用于澳洲坚果进行抗氧化能力的分析。

3 结论与讨论

澳洲坚果果皮是澳洲坚果初加工后遗留的副产物，在整个果实中占较大比重。目前，国内外澳洲坚果加工企业对果皮的回收利用还不够重视，造成资源浪费，而且对环境还有一定的污染。对山核桃[21-22]、柑橘[23]、荔枝[24]等研究表明，果皮含有很多天然抗氧化成分，具有抗氧化、抗致突变、抗衰老、抗炎和抑菌等活性。植物多酚类物质是天然的抗氧化剂，可有效地协助维持体内自由基代谢的平衡，减少或防止相关疾病的发生[25]。虽然张明楷等报道了澳洲坚果果皮富含单宁物質[14]，但对果皮的抗氧化活性尚未有研究。本研究结果表明，澳洲坚果果皮提取物含有较丰富的酚类与黄酮类化合物，对DPPH与ABTS自由基具有较强的清除能力，且具有较高的总抗氧化能力，表明澳洲坚果果皮提取物具有较好的抗氧化活性，可在防衰老、抗炎症等方面发挥作用。然而，对于澳洲坚果果皮提取物中的活性成分及其作用机理，还有待于进一步研究。

不同溶劑制备的提取物中多酚类含量及其抗氧化活性显著不同，这可能与提取剂的极性有关[26]。以水、甲醇、乙醇、丙酮为提取溶剂，提取石榴皮[27]、紫苏草[28]、板栗[29]、高粱[30]、枣果渣[31]的抗氧化活性物质并对其抗氧化活性能力的分析发现，丙酮溶剂提取物的抗氧化活性显著高于其他3种溶剂，其次是甲醇和乙醇，水最低。而菠萝[32]、红薯叶[33]和翠云草[34]的抗氧化研究中发现，甲醇提取溶剂的抗氧化效果最好。本研究中利用不同极性的溶剂提取澳洲坚果果皮中抗氧化物质，所获提取物中的总酚、总黄酮与单宁含量也显著不同，以致不同溶剂提取物清除DPPH和ABTS自由基能力以及总抗氧化能力存在显著差异。其中，丙酮溶剂提取物的抗氧化能力显著高于水、甲醇和乙醇。综合分析4种提取溶剂抗氧化物的FRAP、ABTS和DPPH自由基清除能力可知，4种溶剂提取物均具有一定抗氧化能力，其中丙酮溶剂提取物抗氧化能力最高，其次是甲醇和乙醇，水提取物的抗氧化能力最低。综上所述，体积分数70%丙酮溶剂为提取澳洲坚果果皮中的抗氧化物质最佳溶剂。

通过DPPH、ABTS和FRAP等方法对澳洲坚果果皮抗氧化活性测定发现，总酚含量与3种测定指标均具有显著相关性，该结果也客观反映了3种方法测定澳洲坚果果皮抗氧化活性的准确性。

参考文献：

[1]中国热带农业科学院.中国热带作物产业可持续发展研究[M]. 北京：科学出版社，2014：147-152.

[2]Maguire L S，Oconnor T P，Obrien N M，et al. Fatty acid profile，tocopherol，squalene and phytosterol content of walnuts，almonds，peanuts，hazelnuts and the macadamia nut[J]. Journal of Food Science and Nutrition，2004，55（3）：171-178.

[3]Venkatachalam M，Sathe S K. Chemical composition of selected edible nut seeds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（13）：4705-4714.

[4]杜丽清，邹明宏，曾 辉，等. 澳洲坚果果仁营养成分分析[J]. 营养学报，2010，32（1）：95-96.

[5]杨为海，张明楷，邹明宏，等. 澳洲坚果不同种质果仁粗脂肪及脂肪酸成分的研究[J]. 热带作物学报，2012，33（7）：1297-1302.

[6]Curb J D，Wergowske G，Dobbs J C，et al. Serum lipid effects of high-monounsaturated fat diet based on macadamia nuts[J]. Archives of Internal Medicine，2000，160（8）：1154-1158.

[7]Garg M L，Blake R J，Wills R B. Macadamia nut consumption lowers plasma total and LDL cholesterol levels in hypercholesterolemic men[J]. Journal of Nutrition，2003，133（4）：1060-1063.

[8]石 柳，王金华，熊 智，等. 澳洲坚果壳中纤维素和木质素成分分析[J]. 湖北农业科学，2009，48（11）：2846-2848.

[9]杨为海，张明楷，曾 辉，等. 澳洲坚果种壳矿质元素含量研究[J]. 湖北农业科学，2011，50（23）：4958-4961.

[10]芦燕玲，李亮星，魏 杰，等. 气质联用法分析澳洲坚果壳的挥发性成分[J]. 化学研究与应用，2012，24（3）：433-436.

[11]宁 平，杨月红，彭金辉，等. 澳洲坚果壳活性炭制备的热解特性研究[J]. 林产化学与工业，2006，26（4）：61-64.

[12]陈 玲，孙 浩，缪福俊，等. 澳洲坚果壳滤料的制备与过滤性能的研究[J]. 吉林农业，2011（5）：134-135，137.

[13]刘晓芳，刘满红，张晓梅，等. 澳洲坚果壳活性炭对Cr（VI）的吸附性能[J]. 云南民族大学学报（自然科学版），2012，21（3）：178-181.

[14]张明楷，杨为海，曾 辉，等. 澳洲坚果果皮中主要功能性成分分析[J]. 热带农业科学，2011，31（5）：73-75.

[15]张汉周，张明楷，刘遂飞，等. 澳洲坚果不同种质果皮内含物含量的研究[J]. 热带作物学报，2015，36（3）：541-545.

[16]Singleton V L，Orthofer R，Lamuela-Raventós R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[M]//Packer L. Methods in enzymology，oxidant and antioxidants （Part A）. San Diego：Academic Press，1999：152-178.

[17]Benamar H，Rached W，Derdour A，et al. Screening of algerian medicinal plants for acetylcholinesterase inhibitory activity[J]. Journal of Biological Sciences，2010，10（1）：1-9.

[18]Kunradi V F G，Campelo B G D，Copetti C，et al. Phenolic compounds and antioxidant activity of the Apple flesh and peel of eleven cultivars grown in Brazil[J]. Scientia Horticulturae，2011，128（3）：261-266.

[19]Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology and Medicine，1999，26（9/10）：1231-1237.

[20]Benzie I F，Strain J J. The ferric reducing ability of plasma（FRAP）as a measure of “antioxidant power”：the FRAP assay[J]. Journal of Analytical Biochemistry，1996，239（1）：70-76.

[21]楊琼霞，殷 舒，申屠垠，等. 山核桃外果皮提取液对小鼠的辐射防护作用[J]. 浙江林学院学报，2006，23（6）：604-607.

[22]马良进，吴美卿，苏 秀，等. 山核桃外果皮提取物活体抑菌活性[J]. 浙江林学院学报，2009，26（5）：620-624.

[23]严赞开，胡春菊. 橙皮甙的抑菌效果研究[J]. 西北农业学报，2004，13（2）：87-89.

[24]Wang H C，Hu Z Q，Wang Y，et al. Phenolic compounds and the antioxidant activities in litchi pericarp：difference among cultivars[J]. Scientia Horticulturae，2011，129（4）：784-789.

[25]房昱含，魏玉西，赵爱云，等. 无花果叶提取物抗氧化活性的研究[J]. 中国生化药物杂志，2008，29（6）：366-368，373.

[26]Turkmen N，Sari F，Velioglu Y S. Effect of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin-Ciocalteu methods[J]. Food Chemistry，2006，99（4）：838-841.

[27]张 茜，贾冬英，姚 开，等. 石榴皮提取物的抗氧化作用研究[J]. 中国油脂，2006，31（8）：51-54.

[28]Do Q D，Angkawijaya A E，Tran-Nguyen P L，et al. Effect of extraction solvent on total phenol content，total flavonoid content，and antioxidant activity of Limnophila aromatica[J]. Journal of Food and Drug Analysis，2014，22（3）：296-302.

[29]綦菁华，王 芳，庞美霞，等. 板栗酚类活性成分提取及其抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报，2009，24（9）：141-143，168.

[30]刘 禹，段江莲，李为琴，等. 高粱米不同溶剂提取物的抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报，2013，28（6）：36-39.

[31]王存堂，姜微波，曹建康. 枣果渣不同溶剂提取物的抗氧化成分及性能研究[J]. 食品工业，2015，36（1）：210-213.

[32]Hossain M A，Rahman S. Total phenolics，flavonoids and antioxidant activity of tropical fruit pineapple[J]. Food Research International，2011，44（3）：672-676.

[33]涂宗财，傅志丰，王 辉，等. 红薯叶不同溶剂提取物抗氧化活性及活性成分鉴定[J]. 食品科学，2015，36（17）：1-6.

[34]赖红芳，潘立卫. 翠云草不同溶剂提取物的抗氧化性[J]. 江苏农业科学，2015，43（5）：307-309.薛 菲，刘顺刚，张祥胜，等. 盐地碱蓬叶中可溶性膳食纤维的提取与抗氧化活性[J]. 江苏农业科学，2017，45（1）：175-178.