油茶中产多酚内生真菌的筛选

张婷　左雪枝　赖艳

摘 要：植物内生真菌是指生活在健康植物组织内但并不使寄主产生明显侵染性状的真菌，其代谢产物与宿主有着相同或者相似的生理活性。本研究利用颜色反应和薄层层析法从油茶14株内生真菌中筛选到一株具有产多酚能力的内生真菌（CO-10）。同时结合核糖体基因居间序列（ITS）的序列相似性分析，确定菌株CO-10属于曲霉属真菌。

关键词：颜色反应；薄层层析；多酚；曲霉属

中图分类号：S794.4 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20161132031

内生真菌（Endophytic Fungi）是指存在于健康植物的茎干、叶片或叶柄等组织部位中，度过了全部或近全部生活周期而不使宿主表现任何症状的一类真菌[1]。内生真菌长期存在于宿主体内，与宿主协同进化，建立了良好的、互惠互利的共生关系。

油茶（Camellia oleifera）是我国特有的木本油料树种，是一种常绿、阔叶的生态经济树种。关于油茶内生真菌的研究刚刚起步，周生亮等[2]用免培养法对油茶叶片中的内生真菌进行研究，通过序列测定和比对确定了12个不同的分类操作单元，分属于曲霉属Asperillus、球腔菌科Mycosphaerellaceae、粪壳菌目Sordariales和蜡钉菌目Helotiales。 Zhang等[3]采用传统方法从江西省林科院油茶园中选取了9株油茶健康植物进行内生真菌的分离。结果显示油茶内生真菌的种类涉及59个分类单元，其中芒果球座菌G.mangiferae为油茶内生真菌的优势种，青霉属Penicillum、链格孢属Alternaria、镰孢属Fusarium在油茶不同组织部位也常常出现。虽然这些研究结果均表明油茶的内生真菌种类相当丰富，但有关油茶内生真菌的次生代谢产物研究并未开展。油茶除了主要产品茶油外，还可生成多种生理活性物质，多酚就是其中一种。植物多酚具有抗氧化、延缓机体衰老、抑制糖尿病、高血压等疾病发生的作用，具有可观的应用前景[4]。可是传统的提取方式工序复杂，耗时耗力，效率不高，对环境污染大，且很难实现工业化连续性产出。鉴于此，我们对油茶内生真菌进行分离，希望能找到一种能产多酚的植物内生真菌，利用生物发酵的方式来替代传统的化学浸提法，以实现更高效、更节省、更环保、更方便的连续生产。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

新鲜的油茶组织采自湖北京山，带回实验室在24h内进行内生真菌的分离。

1.2 内生真菌的分离纯化

按照周希等[5]的方法，将油茶组织洗净，表面消毒后，切成小块接种于PDA固体培养基上，在适当条件下培养数天，进行纯化接种，将纯化的菌株保存于PDA斜面培养基中，备用。

1.3 内生真菌的发酵培养

1.3.1 液态发酵

取出保存的菌种活化，活化后进行液体发酵培养。每个菌种接两环于PDA液体培养基中，先静置于28℃恒温箱中12h左右，然后移至28℃恒温摇床上150r/min培养3～5d，注意定时观察。

1.3.2 发酵液的处理

要分离菌和发酵液。对于菌丝生长旺盛已形成大量菌丝球的菌液，直接抽滤，方便快捷；对于菌丝生长不明显或是没用形成明显菌丝体的菌液，可采用离心分离的方法，利用离心机4000r/min离心5min左右即可。

将分离好的发酵液倒入梨形分液漏斗，等体积加入乙酸乙酯加盖充分振荡，静置萃取过夜。分离两相，取上层清夜，即乙酸乙酯相；将菌体经由120℃烘箱烘干，加灭菌石英砂研磨成粉状，用适量乙酸乙酯浸提过夜后，4000r/min离心5min分离。将液相与同种菌的发酵液的乙酸乙酯相合并后真空旋转蒸发蒸干，得到的膏状物质。用5mL甲醇溶解，分装到4个1.5mLEP管中，4℃低温保存备用。

1.4 筛选及鉴定

1.4.1 筛选

用酒石酸亚铁颜色反应进行初筛，用薄层层析法进行复筛。复筛时，以没食子酸为标准品，展层剂为苯和乙醇的混合物，展层后喷洒显色剂（醋酸-亚硝酸钠-氢氧化钠）检测。

1.4.2 菌株的鉴定

鉴定采用分子鉴定，用CTAB法提取真菌的基因组

DNA，擴增反应所用引物为ITS-1（5- TCCGTAGGTG-

AACCTGCGG-3）和ITS-4（5-TCCTCCGCTT-ATTGTATGC-3）[6]。扩增、克隆后送取适量阳性克隆子的菌液送武汉博奥生物技术有限责任公司进行测序。将测定的序列以NCBI GENBANK数据库中的相似序列比对分析，再用MEGA软件进行聚类分析，根据聚类分析图确定分类地位。

2 结果与分析

2.1 油茶内生真菌的分离结果

油茶组织块在接着3d后，组织块边缘就有菌丝长出，随着培养时间的延长，长出的菌丝种类逐渐增多，在每一次观察到有新菌丝长出时，都及时进行了转接、纯化，最后共得到14株形态不同的内生真菌菌株，这14株内生真菌菌株的编号及菌落特征如表1所示。

2.2 筛选结果

经过酒石酸亚铁颜色反应初筛显示仅CO-10反应后呈现蓝色，提示可能含有多酚类物质。复筛结果如图1所示，对初筛出的菌株发酵提取物和没食子酸标准样对照进行薄层层析，发现检测样品有一个与标准样迁移率相同的斑点，说明样品中可能含有茶多酚。

2.3 分子鉴定

菌株CO-10提取基因组DNA后，对其进行PCR扩增，得到长度约为630bp的扩增片段。以链格孢属菌株（Alternaria sp.）为外群，按照NJ（neighbor-joining）法所构的聚类分析图如图2所示。CO-10与曲霉属的菌株聚为一支，自信值为100，从而判断CO-10属曲霉属Aspergillus.

3 讨论

内生真菌存在于植物体内，通常能产生与植株相同或相似的次生代谢产物，张海龙等[7]从银杏中筛选出了2株具有产黄酮化合物能力的内生真菌，徐慧超等[8]从甘草中筛选出了一株内生真菌RE7，从其发酵液中分离得到了甘草次酸；吴晓民等[9]从珍贵药用植物高山红景天中得到了一株可产红景天苷的内生真菌G5；正是由于内生真菌能够产生各种各样的抗肿瘤、抗氧化、抗菌等作用的生理活性物质，引起了无数研究者的热情。

本研究利用常规的组织分离法分离来自湖北京山油茶样品中的内生真菌，油茶组织经过严格消毒后共分离到14株形态不一的内生真菌，说明在油茶的不同组织部位均有内生真菌分布。对分离到的内生真菌进行液体培养，浓缩发酵液，并用极性有机溶剂萃取。由于多酚中的羟基与铁离子螯合可生成蓝紫色的络合物，因此用酒石酸亚铁进行颜色反应初筛，初筛结果显示CO-10可能具有产多酚物质的能力。多酚类物质的种类很多，在复筛中以没食子酸做标准品，检测CO-10的代谢物种是否有与没食子酸结构相似的物质存在，层析结果显示在CO-10的层析斑点中具有与没食子酸一样迁移率的斑点，说明菌株CO-10能产生与没食子酸结构相似的多酚类物质。

分子鉴定已成为真菌分类的一种有力的和必不可少的方法。在DNA标记中，ITS区域是最常用于物种鉴定的，它被认为是真菌的条形码，已成功地鉴定了70%的真菌[10]。本研究对菌株CO-10的分子鉴定结果显示其属于曲霉属Aspergillus，在陈可可等[11]的研究中发现曲霉属真菌能控制后发酵过程，能改变普洱茶中茶多酚的组成与含量，但是对于其具体作用机制并未作出明确解释。结合本研究结果，推测其原因可能是由于曲霉属真菌具有产多酚类物质的能力，也可能是由于曲霉属真菌能够产多酚形成过程中的一些酶类，从而促进了物质向某一特定方向的转化过程。

内生真菌作为一种新开发的微生物资源，具有微生物生长和繁殖快速、培养简便、成本低廉等优点，且能产生丰富的代谢产物，有望突破植物资源缺乏、再生周期长等限制，成为天然活性化合物生产的新途径。因此，在后续的研究中，还需测定菌株CO-10产多酚类物质的能力，并选取一定的方法提高其产量，加快育种工作。

参考文献

[1]徐亚军.植物内生菌资源多样性研究进展[J].广东农业科学，2011（24）：149-152.

[2]Zhou SL，Yan SZ，Wu ZY，et al.Detection of endophytic fungi within foliar tissues of Camellia oleifera based on rDNA ITS sequences[J].Mycosystem，2013，32（5）：819-830.

[3]张林平，张扬，王舒，等.油茶不同部位的内生真菌组成及多样性分析[J].林业科技开发，2013，27（6）：101-105.

[4]陈亮，李医明，陈凯先，等.植物多酚类成分提取分离研究进展[J].中草药，2013，44（11）：1501-1508.

[5]周希，张婷，张苗，等.油茶内生真菌的分离[J].安徽农业科学，2012，40（16）：8958-8959.

[6]刘紫英.产黄酮成分的绶草内生真菌的鉴定[J].菌物学报， 2011，30（1）：133-137.

[7]張龙海，李善春，卢维浩，等.银杏内生真菌多样性与产黄酮类物质真菌的分离和鉴定[J].土壤，2015，47（1）：135-141.

[8]徐慧超，孙婷媛，翟李欣，等.产甘草次酸内生真菌RE7的鉴定及抑菌活性研究[J].中国新药杂志，2016，25（1）：102-117.

[9]吴晓民，任谓明，杨信东，等.高山红景天内生真菌的分离及产红景天苷菌株的筛选[J].时珍国医国药，2014，25（11）：2769-2772.

[10]Chen J，Zhang LC，Xing YM，et al. Diversity and taxonomy of endophytic Xylariaceous Fungi from medicinal plants of Dendrobium （Orchidaceae）[J].PLOS ONE，20138（3）：e58268.

[11]陈可可，张香兰，朱宏涛，等.曲霉属真菌在普洱茶后发酵中的作用[J].云南植物研究，2008，30（5）：624-628.

作者简介：张婷（1980-），女，硕士，讲师，主要从事：微生物资源利用研究。