西方蜜蜂工蜂不同虫态发育的转录组学分析

宋文菲　胡宗文　苗春辉　余玉生　杨爽　李亚辉

摘要：【目的】基于转录组学对西方蜜蜂工蜂不同虫态间的差异表达基因（DEGs）进行筛选和功能注释分析，揭示与工蜂生长发育相关的信号通路，为深入解析工蜂生长发育的分子调控机理提供基础数据。【方法】以西方蜜蜂工蜂的3日龄幼虫、1日龄蛹和1日龄羽化工蜂3个虫态为研究对象，利用llumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序，采用DESeq2筛选不同虫态样品间的表达差异基因，然后分别进行GO功能注释分析及KEGG信号通路富集分析，并通过实时荧光定量PCR进行验证。【结果】经转录组测序，在西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫与1日龄蛹间筛选出4823个差异表达基因（51.86%上调，48.14%下调），在1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间筛选出3295个差异表达基因（57.51%上调，42.49%下调），在3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间筛选出5267个差异表达基因（52.95%上调，47.05%下调）。GO功能注释分析结果显示，3日龄幼虫与1日龄蛹间的差异表达基因注释到43个GO功能条目，1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间的差异表达基因注释到45个GO功能条目，3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间的差异表达基因注释到44个GO功能条目，主要涉及细胞过程、细胞部分及结合等。KEGG信号通路富集分析发现，3日龄幼虫与1日龄蛹间有2905个差异表达基因富集到332条KEGG信号通路上，其中17条KEGG信号通路呈显著富集，涉及核糖体、氧化磷酸化和昆虫激素生物合成等;1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间有1644个差异表达基因富集到331条KEGG信号通路上，其中45条KEGG信号通路呈显著富集，涉及氧化磷酸化、生热作用和胰岛素分泌等;3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间有2958个差异表达基因富集到337条KEGG信号通路上，其中14条KEGG信号通路呈显著富集，涉及核糖体、蛋白酶体和胰岛素分泌等。6个随机挑选差异表达基因的实时荧光定量PCR检测结果与转录组测序结果相符，即转录组测序结果可靠。【结论】昆虫激素生物合成通路相关差异表达基因调控与西方蜜蜂工蜂各虫态JH滴度变化规律一致，氧化磷酸化信号通路则与各虫态的营养摄入和活动行为相关，而胰岛素分泌通路涉及各虫态的营养调控、脂肪体合成及细胞凋亡。可见，昆虫激素生物合成、胰岛素分泌和氧化磷酸化3种信号通路在西方蜜蜂工蜂幼虫、蛹和成虫的发育调控中发挥着重要作用。

关键词：西方蜜蜂;工蜂;生长发育;差异表达基因;信号通路;转录组测序

中图分类号：S891                          文獻标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）03-0748-11

Transcriptome analysis of development of different stages in Apis mellifera worker bees

SONG Wen-fei HU Zong-wen MIAO Chun-hui YU Yu-sheng YANG Shuang LI Ya-hui

（1College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan  650201， China;

2Sericulture and Apiculture Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences，

Mengzi， Yunnan  661101， China）

Abstract：【Objective】To screen and functional annotation analysis of differentially expressed genes （DEGs） among different stages of Apis mellifera worker bees based on transcriptomics， reveal signaling pathways related to development of worker bees，so as to provide basic data for in-depth analysis of the molecular regulation mechanism of growth and deve-lopment of worker bees. 【Method】The 3-day-old larvae，1-day-old pupae and 1-day-old eclosion worker bees were takenas the research objects. Transcriptome sequencing was performed by Illumina NovaSeq 6000 platform，and screening of DEGs among different worker bees samples by DESeq2. GO functional annotation analysis and KEGG signaling pathway enrichment analysis were performed， and then real-time quantative PCR （qRT-PCR） verification was conducted. 【Result】After transcriptome sequencing， 4823 DEGs （51.86% up-regulated， 48.14% down-regulated） were screened between 3-day-old larvae and 1-day-old pupae of A. mellifera worker bees. 3295 DEGs were screened between 1-day-old pupae and 1-day-old eclosion worker bees （57.51% up-regulated， 42.49% down-regulated）， 5267 DEGs （52.95% up-regulated， 47.05% down-regulated） were screened between 3-day-old larvae and 1-day-old eclosion worker bees. The annotated GO function entries in the GO database of the three instar differential genes were 43 （between 3-day-old larvae and 1-day-old pupae）， 45 （between 1-day-old pupae and 1-day-old eclosion worker bees）， and 44 （between 3-day-old larvae and 1-day-old eclosion worker bees） respectively， mainly involving cellular process， cell part， binding， etc. KEGG signaling pathway enrichment analysis results showed that 2905 DEGs were enriched in 332 KEGG signaling pathways between 3-day-old larvae and 1-day-old pupae， of which 17 KEGG signaling pathways were significantly enriched， involving ribosomes， oxidation phosphorylation and insect hormone biosynthesis.1644 DEGs were enriched in 331 KEGG signaling pathways between 1-day-old pupae and 1-day-old eclosion worker bees， of which 45 KEGG signaling pathways were significantly enriched， involving oxidative phosphorylation， thermogenesis and insulin secretion. 2958 DEGs were enriched in 337 KEGG signaling pathways between 3-day-old larvae and 1-day-old eclosion worker bees， of which 14 KEGG signaling pathways were significantly enriched， involving ribosomes， proteasomes and insulin secretion. The qRT-PCR results of 6 randomly selected DEGs were consistent with the transcriptome sequencing results， indicating that the transcriptome sequencing results were reliable. 【Conclusion】The regulation of DEGs related to insect hormone biosynthesis pathway is consistent with the change rule of juvenile hormone（JH） titer in different stages of A. mellifera worker bees. The oxidative phosphorylation signaling pathway is related to the nutrient intake and activity behavior of different stages， and the insulin secretion pathway involves in the regulation of nutritional regulation， fat body synthesis and apoptosis of diffe-rent stages. The results showsthat three signaling pathways of insect hormone biosynthesis， insulin secretion and oxidative phosphorylation play important roles in the developmental regulation of larvae， pupae and adult of A. mellifera worker bees.4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1

Key words：Apis mellifera;worker bees; growth and development; differentially expressed genes;signaling pathway; transcriptome sequencing

Foundation items：National Modern Agriculture Industry Technology System（Honey Bee） Construction Project（CARS-44-SYZ16）; Yunnan Province Science and Technology Plan Project （202105AF150052）; Yunan Science and Technology Mission Funding Project （202204BI090013）

0 引言

【研究意義】西方蜜蜂（Apis mellifera L.）是一类以雌性为主的社会性昆虫，受级型分化影响雌性单元分化为蜂王和工蜂，蜂王负责繁殖后代和维持秩序，而数量最多的工蜂承担着觅食、哺育及筑巢等职能分工（Amdam and Seehuus，2006;Barchuk et al.，2007;宋文菲等，2021）。工蜂在生长发育过程中受到营养物质和内激素的共同影响（李成成等，2011;Wang et al.，2014），如缺少花粉会引起幼虫和成年工蜂的发育受阻（Wang et al.，2014;Di Pasquale et al.，2016;Martin et al.，2021）。内激素主要包括保幼激素（Juvenile hormone，JH）和蜕皮激素（20-hydroxyecdysone，20E），会影响工蜂的变态发育和级型分化（李茫等，2019）。至今，针对西方蜜蜂（工蜂和蜂王）幼虫阶段差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）和代谢通路的研究已有相关报道，证实工蜂和蜂王的幼虫在不同发育阶段的基因种类和表达水平存在明显差异，蜂王在幼虫早期具有独特的基因表达谱，hexamerin 70b基因和雷帕霉素靶蛋白（TOR）信号通路与其级型分化密切相关（Chen et al.，2012;Cameron et al.，2013;He et al.，2017）。但关于西方蜜蜂工蜂胚后发育的分子调控机理尚不清楚，因此分析工蜂各虫态的差异表达基因及其信号通路，可为深入探究工蜂生长发育的分子调控机理提供理论依据。【前人研究进展】随着昆虫基因组学及转录组学等分子生物信息学的快速发展，有关西方蜜蜂级型分化、行为分化和生长发育等方面的代谢通路调控机理研究已取得阶段性进展（Patel et al.，2007;Wang et al.，2013;Harpur et al.，2014）。研究表明，JH是调控西方蜜蜂变态发育和级型分化的关键因子，其表达水平受表皮生长因子受体（EGFR）信号调控，以及胰岛素受体底物（IRS）和TOR信号通路的影响（Patel et al.，2007;Kamakura，2011;Mutti et al.，2011）;对蜜蜂幼虫的IRS和TOR基因进行RNA干扰，可引起体内JH水平下降，进而诱导幼虫发育成为工蜂（Patel et al.，2007;Muttiet al.，2011）。胰岛素/胰岛素样生长因子信号（IIS）也是工蜂生长发育的调控因子，通过营养调控和行为分化等方式影响工蜂的发育。Ament等（2008）研究发现，采集蜂在大脑和腹部的IIS基因表达水平高于哺育蜂，说明IIS可调控成年工蜂的行为分化。Wang等（2013）研究表明，IIS信号通路中的AmILP1和AmILP2基因在工蜂幼虫发育过程中发挥着不同作用，AmILP1基因能显著降低JH水平，AmILP2基因对脂肪体起调控作用，对幼虫发育及其体重均有影响。AmILP-2基因是胰岛素样肽主要转录基因，在工蜂中的表达量明显高于蜂王，说明组织特异性与IIS信号通路相对独立（de Azevedo and Hartfelder，2008）。与蜂王相比，在工蜂幼虫早期和中期发育中以氨基酸、肌肉发育和一般代谢相关基因的表达较高，在幼虫中后期则是与细胞凋亡（组织蛋白酶）和自噬细胞死亡的相关基因表达较高（Cameron et al.，2013）;不同年龄段工蜂的劳动分工也是通过JH信号通路、胰岛素样/TOR信号通路相互作用来调节，其体内存在着较多的高表达新基因（Johnson and Tsutsui，2011;Harpur et al.，2014）。有关20E对工蜂生长发育的影响，Hartfelder和Engels（1998）研究发现，20E在工蜂幼虫阶段的滴度水平较低，但在预蛹期和成虫期分别出现一个峰值;祝智威等（2022）研究证实，3种微小RNA可通过调控20E基因及Hippo和FoxO信号通路的相关基因而影响工蜂蛹期的变态发育过程。【本研究切入点】工蜂是西方蜜蜂蜂群中数量最多的类型，其生长发育对蜂群的发展至关重要。近年来，基于转录组学对西方蜜蜂工蜂哺育行为相关基因、工蜂中肠发育基因的研究表明，工蜂的哺育行为受信号转导和能量代谢等途径的调控（高艳等，2020），而TGF-β、Wnt及Hippo等信号通路影响工蜂中肠的生长发育和免疫能力（杜宇等，2020）。目前有关蜜蜂工蜂和蜂王级型分化差异表达基因及代谢通路的研究已有相关报道（Chen et al.，2012;Cameron et al.，2013;He et al.，2017），但针对工蜂不同虫态间的信号通路及调控作用研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过对西方蜜蜂工蜂的3日龄幼虫、1日龄蛹和1日龄羽化工蜂3个虫态进行转录组测序，并对各虫态间的差异表达基因进行筛选和功能注释分析，揭示与工蜂生长发育相关的信号通路，为深入解析工蜂生长发育的分子调控机理提供基础数据。4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试西方蜜蜂蜂群由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所国家现代农业产业技术体系（蜜蜂）红河综合试验站西方蜜蜂试验蜂场提供。2021年4—5月选择3群群势相当的蜂群，每群放1张空巢脾，待蜂王产卵后收集幼虫、蛹和成虫3个发育虫态。为保证相邻虫態间发育时间相同，以相邻虫态间隔6～7 d取样（Wang et al.，2015），分别以3日龄幼虫、1日龄蛹和1日龄羽化工蜂代表幼虫期、蛹期及成虫期。3日龄幼虫以6头为1个样本，1日龄蛹和1日龄羽化工蜂则以3头为1个样本，每个样本设3个生物学重复。样品采集后立即放入液氮中冻毙，-80 ℃保存备用。TRIzol试剂（Invitrogen）、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser RT-qPCR反转录试剂盒及TB Green Premix Ex Taq II购自宝日医生物技术（北京）有限公司，DEPC水购自北京索莱宝科技有限公司。主要仪器设备有NanoDrop 2000型分光光度计（Thermo Scientific）、StepOnePlusTM型qPCR仪（Applied Biosystems公司）、梯度PCR仪（Applied Biosystems公司）、低温高速离心机（Sigma公司）及HWS智能型恒温恒湿箱（宁波江南仪器厂）等。

1. 2 cDNA文库构建及转录组测序

采集样品在液氮中充分研磨后，根据TRIzol试剂操作说明提取总RNA，利用NanoDrop 2000进行RNA浓度和纯度检测，以琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，采用Agilent 2100 Nano测定RIN值。质检合格的RNA，根据TruseqTM RNA Sample Preparation Kit （Illumina）试剂盒说明构建cDNA文库，然后利用llumina HiSeq Xten/NovaSeq 6000平台进行高通量测序，获得原始数据。基于西方蜜蜂基因组序列，利用HISAT2序列比对软件与蜜蜂的基因组注释信息进行比对（Kim et al.，2015），并将基因/转录本在Nr、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG等数据库中进行注释，全面获得基因/转录本的注释信息。

1. 3 转录组数据处理及注释分析

利用Cufflinks计算FPKM值，即每百万个外显子映射的片段数，用以评估基因表达水平（Trapnell et al.，2010;张蕾等，2020）。采用DESeq2筛选不同虫态样品组间的表达差异基因，筛选参数设为P<0.01且|log₂Fold Change|≥1，上调/下调差异倍数为2。

1. 4 实时荧光定量PCR验证

从西方蜜蜂工蜂不同虫态转录组数据中随机挑选6个差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证，分别是腺苷酸环化酶 3基因（Ac3）、蛋白激酶C基因（Pkc）、细胞色素 P450 302a1基因（LOC727118）、胰岛素样肽2基因（ILP-2）、法尼酸甲酯环氧酶基因（LOC551179）和保幼激素酸O-甲基转移酶基因（LOC724216）。采用Primer Premier 5.0设计6个差异表达基因的扩增引物，参照Zhang等（2020）的方法设计内参基因（GAPDH）扩增引物，所有引物（表1）均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用反转录试剂盒将提取的RNA反转录合成cDNA，获得的cDNA 置于-20 ℃冰箱保存备用。实时荧光定量PCR反应体系20.0 μL：TB Green Premix Ex Taq II 10.0 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH₂O 6.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性10 min;95 ℃ 15 s，57 ℃ 1 min，进行40个循环;添加熔解曲线。设3个水平重复孔，采用2^-DDCt法换算目的基因相对表达量。

2 结果与分析

2. 1 转录组测序数据质控分析结果

Illumina HiSeq 6000平台高通量测序结果（表2）显示，西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫、1日龄蛹和1日龄羽化工蜂的有效序列（Clean reads）分别为44384567、42199177和41901170条。各样本的Q30均在93.00%以上，GC含量在35.66%～39.61%，表明转录组测序数据质量良好，可用于后续的研究分析。

2. 2 西方蜜蜂工蜂不同虫态间差异表达基因分析结果

在西方蜜蜂工蜂3个虫态中，3日龄幼虫与1日龄蛹间存在4823个差异表达基因，表现为51.86%的差异表达基因上调、48.14%的差异表达基因下调（图1-A）;1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间存在3295个差异表达基因，表现为57.51%的差异表达基因上调、42.49%的差异表达基因下调（图1-B）;3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间存在5267个差异表达基因，表现为52.95%的差异表达基因上调、47.05%的差异表达基因下调（图1-C）。

2. 3 差异表达基因GO功能注释分析结果

3日龄幼虫与1日龄蛹间的4823个差异表达基因共注释到43个GO功能条目。其中，以注释到生物学过程（Biological process）的功能条目最多，有16个（占37.21%），主要涉及细胞过程（Cellular process）（935个差异表达基因，占19.39%）、代谢过程（Metabolic process）（978个差异表达基因，占20.28%）、生物调节（Biological regulation）（333个差异表达基因，占6.90%）等;注释到细胞组分（Cellular component）的功能条目有15个（占34.88%），主要涉及膜部分（Membrane part）（839个差异表达基因，占17.40%）、细胞部分（Cell part）（756个差异表达基因，占15.67%）、含蛋白质复合物（Protein-containing complex）（315个差异表达基因，占6.53%）等;注释到分子功能（Molecular function）的功能条目有12个（占27.91%），主要涉及结合（Binding）（1032个差异表达基因，占21.40%）、催化活性（Catalytic activity）（948个差异表达基因s，占19.66%）、转运蛋白活性（Transporter activity）（161个差异表达基因，占3.34%）等（图2-A）。4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1

1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间的3295个差异基因共注释到45个GO功能条目，同样以注释到生物学过程的功能条目最多，有17个（占37.78%），主要涉及细胞过程（549个差异表达基因，占16.67%）、代谢过程（562个差异表达基因，占17.06%）、生物调节（264个差异表达基因，占8.01%）等;注释到细胞组分的功能条目有15个（占33.33%），主要涉及膜部分（670个差异表达基因，占20.33%）、细胞部分（383个差异表达基因，占11.62%）、膜（Membrane）（199个差异表达基因，占6.04%）等;注释到分子功能的功能条目有13个（占28.89%），主要涉及结合（624个差异表达基因，占18.94%）、催化活性（619个差异表达基因，占18.79%）、转运蛋白活性（153个差异表达基因，占4.64%）等（图2-B）。

3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间的5267个差异基因共注释到44个GO功能条目，同样以注释到生物学过程的功能条目最多，占50.00%，主要涉及细胞过程（1020个差异表达基因，占19.37%）、代谢过程（1022个差异表达基因，占19.4%）、生物调节（430个差异表达基因，占8.16%）等;注释到细胞组分的功能条目有15个（占34.09%），主要涉及膜部分（936个差异表达基因，占17.77%）、细胞部分（786个差异表达基因，占14.92%）、细胞器（Organelle）（313个差异表达基因，占5.94%）等;注释到分子功能的功能条目有12个（占27.27%），主要涉及结合（1112个差异表达基因，占21.11%）、催化活性（1010个差异表达基因，占19.18%）、转运蛋白活性（165个差异表达基因，占3.13%）等（图2-C）。

2. 4 差异表达基因KEGG信号通路富集分析结果

在KEGG数据库中比对获得差异表达基因6351个，涉及有机体系统（Organismal systems）、细胞过程（Cellular process）、环境信息处理（Environmental information processing）、遗传信息处理（Genetic information processing）和新陈代谢（Metabolism）五大类（图3）。其中，有机体系统通路富集到的差异表达基因数最多（1736个），占可注释基因数的27.33%，且以与内分泌系统相关的基因最多;新陈代谢通路富集到的差异表达基因次之（1521个），占23.95%，以与碳水化合物代谢相关的基因最多;遗传信息处理通路富集到1095个差异表达基因，占17.24%，以与翻译相关的基因最多;细胞过程通路富集到1076个差异表达基因，占16.94%，以与运输和分解代谢相关的基因最多;环境信息处理通路富集到923个差异表达基因，占14.53%，以与信号转导相关的基因最多。

在西方蜜蜂工蜂3個虫态中，3日龄幼虫与1日龄蛹间有2905个差异表达基因富集到332条KEGG信号通路上，其中17条KEGG信号通路呈显著富集（图4-A），包括核糖体（Ribosome，102个）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation，74个）和昆虫激素生物合成（Insect hormone biosynthesis，19个）等。1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间有1644个差异表达基因富集到331条KEGG信号通路上，其中45条KEGG信号通路呈显著富集（图4-B），包括氧化磷酸化（74个）、生热作用（Thermogenesis，83个）和胰岛素分泌（Insulin secretion，25个）等。3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间有2958个差异表达基因富集到337条KEGG信号通路上，其中14条KEGG信号通路呈显著富集（图4-C），包括核糖体（104个）、蛋白酶体（Proteasome，32个）和胰岛素分泌（28个）等。

从昆虫激素生物合成通路上挑选6个差异表达基因进行分析，结果（表3）显示，这6个差异表达基因从3日龄幼虫到1日龄蛹出现整体下调的表达趋势，但从1日龄蛹到1日龄羽化工蜂呈整体上调的表达趋势。同时从胰岛素信号通路上挑选6个差异表达基因进行分析，结果（表4）发现从3日龄幼虫到1日龄羽化工蜂，40S核糖体蛋白S6基因（LOC725647）持续下调;ILP-2基因、胰岛素样受体样转录变体 X3基因（InR-2）和mTOR调节相关蛋白基因（LOC551668）呈先上调后下调的表达趋势;己糖激酶1样基因（LOC408818）和脂肪酸合酶基因（LOC412815）则呈先下调后上调的表达趋势。

2. 5 转录组数据实时荧光定量PCR验证结果

从西方蜜蜂工蜂不同虫态的转录组数据中随机挑选6个差异表达基因（Ac3、Pkc、ILP-2、LOC727118、LOC551179和LOC724216），采用实时荧光定量PCR进行验证，结果（图5）表明，在不同虫态中6个差异表达基因的实时荧光定量PCR检测结果与转录组测序结果相符，进一步证实了转录组数据结果的可靠性。

3 讨论

氧化磷酸化是生物体分解过程中氧化步骤所释放的能量，并驱动ATP的合成过程（Waites and  Garner，2011）。本研究对西方蜜蜂工蜂的3日龄幼虫、1日龄蛹和1日龄羽化工蜂进行转录组测序分析，结果发现：3日龄幼虫与1日龄蛹间有102个差异表达基因显著富集在核糖体通路上，包括RpL32、RpL41及Rps14等101个下调基因，仅有1个基因（LOC724629）上调;有74个差异表达基因显著富集在氧化磷酸化通路上，包括Cox6c、Ndufs1和Ndufs5等72个下调基因，而LOC408734和LOC100578821基因上调。1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间有74个差异表达基因显著富集在氧化磷酸化通路上，包括Uqcr11、Cox6c和Ndufs5等72个上调基因，而LOC727212和LOC551917基因下调。与蛹和羽化工蜂相比，工蜂会在幼虫期摄入更多食物，如蜂王浆、花粉及哺育蜂下颚腺分泌物混合物质，因而表现为幼虫发育阶段的氧化磷酸化增强（Cameron et al.，2013），与本研究中3日龄幼虫与1日龄蛹间的氧化磷酸化通路差异表达基因下调的结果一致。氧化磷酸化通路差异表达基因在1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间上调，故推测是羽化工蜂的行为活动引起氧化磷酸化增强所致。核糖体是由rRNA及核糖体蛋白组成的颗粒状结构，其中核糖体蛋白主要参与蛋白质的合成、调控转录和细胞凋亡等生理过程（Warner and Mclntosh，2009）。Verras等（2004）在地中海实蝇（Ceratitis capitate）中也发现，核糖体蛋白基因CcRpS21在胚胎和幼虫的表达量高于蛹和成虫，该结论在本研究中得到进一步验证。此外，有研究发现核糖体蛋白对昆虫卵的滞育有重要调控作用（李艳艳等，2021），因此相关核糖体蛋白基因的功能值得后续深入研究。4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1

昆虫变态发育主要由JH和20E协同调控完成，其中，JH在调控西方蜜蜂工蜂生长和变态发育过程中发挥关键作用（洪芳等，2016;李茫等，2019;张慧等，2021）。本研究中，西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫与1日龄蛹间的昆虫激素生物合成通路显著富集，对昆虫内分泌激素相关的6个差异表达基因进行分析，结果发现3日龄幼虫与1日龄蛹间的6个差异表达基因整体下调，而1日龄蛹到1日龄羽化工蜂呈整体上调趋势。在西方蜜蜂工蜂的生长发育过程中，JH滴度也表现出3日龄幼虫高于蛹和羽化工蜂（Hartfelder and Engels，1998）。由于工蜂3日龄仍处于幼虫早期，在完全变态昆虫中其幼虫期体内需保持一定的JH水平，以维持虫体处于幼虫虫态，而化蛹前的JH水平下降及蜕皮激素上升，幼虫才能正常化蛹（Truman and Riddiford，1999）。此外，3～5日龄幼虫是西方蜜蜂幼虫级型分化的关键期，此时幼虫在摄入蜂王浆后可进一步提高JH滴度，且能通过蜂王浆和JH转向蜂王发育，低龄幼虫维持一定的JH水平以实现幼虫的可塑性（Mutti et al.，2011）。故推测西方蜜蜂工蜂由于受到变态发育和级型分化的影响，导致从3日龄幼虫到羽化工蜂其昆虫激素生物合成相关差异表达基因的表达发生明显变化。

胰岛素是一种蛋白质激素，通过IIS信号通路发挥作用，可调节生物细胞的生长、代谢及繁殖等（Oldham and Hafen，2003;Wullschleger et al.，2006;Corona et al.，2007）。本研究发现1日龄蛹与1日龄羽化工蜂、3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂的胰岛素分泌信号通路显著富集，通过对胰岛素分泌及胰岛素信号通路中的6个差异表达基因进行分析，结果表明，从3日龄幼虫到1日龄成虫间，ILP-2、InR-2和LOC551668基因呈现出先上调后下调的表达趋势，且下调幅度较明显;而LOC408818和LOC412815基因呈先下调后上调的表达趋势，下调幅度较明显;LOC725647基因的表达则持续下调。李兆英（2013）研究发现，意大利蜜蜂工蜂在幼虫期的脂肪体细胞数量增长较快，而在蛹早期出现脂肪体细胞凋亡，之后组建成虫新的脂肪体，与本研究中的LOC412815基因调控结果基本一致。此外，mTOR调节相关蛋白和40S核糖体蛋白S6可调节细胞的生长、增殖和凋亡（Miron and Sonenberg，2001;Wolschin et al.，2011），故推测LOC725647和LOC551668基因可能参与工蜂胚后发育过程中脂肪体细胞的增殖和凋亡过程。de Azevedo和Hartfelder（2008）研究发现，西方蜜蜂工蜂ILP2基因从3龄幼虫到5龄呈上調表达趋势，在5龄幼虫摄食期间显著上升，之后呈下调表达;InR-2基因从3龄幼虫到5龄整体也呈上调趋势，5龄幼虫摄食期后开始下调。说明胰岛素信号通路可能参与了工蜂幼虫期的营养调控、脂肪体合成，以及蛹期的脂肪体凋亡过程。

4 结论

昆虫激素生物合成通路相关差异表达基因调控与西方蜜蜂工蜂各虫态JH滴度变化规律一致，氧化磷酸化信号通路则与各虫态的营养摄入和活动行为相关，而胰岛素分泌通路涉及各虫态的JH水平、脂肪体合成及行为分化调控。可见，昆虫激素生物合成、胰岛素分泌和氧化磷酸化3种信号通路在西方蜜蜂工蜂生长发育调控中发挥着重要作用。

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（責任编辑 兰宗宝）4293EE6F-6C74-4C82-858F-238197A4E9A1