柴胡转录组SSR的分布及序列特征分析

刘迪　欧阳艳飞　徐鹏　甄军波　刘琳琳　张利超　迟吉娜

摘要：【目的】分析柴胡轉录组中SSR的分布及序列特征，为开发多态性良好的、功能基因相关的SSR标记提供理论依据。【方法】以不同温度处理的柴胡种子为材料，经高通量转录组测序后，使用Trinity对测序结果进行de novo组装，并利用MISA对组装得到的Unigenes进行SSR位点搜索，最后统计分析SSR的分布及序列特征。【结果】从转录组数据组装获得244194条Unigenes，其N50值为1036 bp，平均长度791 bp，总长度193138105 bp。从Unigenes序列中共检测到50303个SSR位点，去除20405个复合型SSR位点，以29898个单一型SSR位点为后续分析对象。转录组SSR的出现频率为12.24%，平均分布距离6.46 kb，主要重复基元类型为二核苷酸，共17105个，占SSR总数的57.21%，其次为三核苷酸和单核苷酸，分别占SSR总数的20.75%和20.46%，四核苷酸～六核苷酸重复基元数量均较少。转录组SSR中，共有97种重复基元，其中二核苷酸和三核苷酸重复基元分别以AT/AT和ATC/GAT为主，分别占SSR总数的33.33%和3.98%;重复次数5～10次的SSR位点数量最多，共27942个，占SSR总数的93.46%。转录组SSR序列长度存在明显差异（12～76 bp），平均长度15.28 bp。【结论】柴胡转录组的SSR位点出现频率较高，类型较丰富，具有开发出高多态性SSR分子标记的潜力，将其用于柴胡的遗传多样性分析、种质资源评价及分子标记辅助育种等研究。

关键词： 柴胡;转录组;SSR;分布;序列特征

中图分类号： S567.79                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）03-0676-08

Analysis of SSR distribution and sequence characteristics of Bupleurum chinense DC. transcriptome

LIU Di OUYANG Yan-fei XU Peng ZHEN Jun-bo LIU Lin-lin ZHANG Li-chao CHI Ji-na

（1Cotton Research Institute，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Cotton Biology and Genetic Breeding in Huanghuaihai Semiarid Area，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shijiazhuang， Hebei 050051， China; 2Chengde Chinese Herbal Medicine Green Ecological Planting Technology Service Center，

Chengde， Hebei  067000， China）

Abstract：【Objective】The SSR locus information and sequence characteristics in the transcriptome of Bupleurum chinense DC. were analyzed， so as to provide the basis for the development of functional gene-related SSR markers with good polymorphism. 【Method】 The processed seeds of B. chinense were used as materials to perform high-throughput transcriptome sequencing. Trinity was used to assemble the sequencing results for De Novo assembly. The unigenes obtained were searched for the presence of SSR sites by MISA software and then the SSR data was statistically analyzed. 【Result】 244194 unigenes were assembled from B. chinense DC. The transcriptome data had an N50 value of 1036 bp， an average length of 791 bp and a total length of 193138105 bp. A total of 50303 SSR loci were identified from the unigene sequences， among which 20405 were complex SSR loci and 29898 SSR loci were actually analyzed. The frequency of SSR accounted for 12.24% of all unigenes with an average distribution distance of 6.46 kb. The major repeat motifs were dinucleotide （17105）， accounting for 57.21% of all SSRs，followed by trinucleotide and mononucleotide （20.75% and 20.46%，respectively）. The proportion of tetranucleotide repeat units to hexanucleotide repeat units was low. 97 kinds of repeat motifs were found in the B. chinense DC. transcriptome. The main repeat motif types in dinucleotide were AT/AT and in trinucleotide were ATC/GAT，which accounted for 33.33% and 3.98% of the total SSR， respectively. The types of SSR repeat units with 5 to 10 repeats had the highest proportion， with a total of 27942， accounting for 93.46% of the total SSRs. The sequence length ranged from 12 bp to 76 bp， with an average length of 15.28 bp. 【Conclusion】 The SSR loci in the B. chinense transcriptome have high frequency and diversity， and it is possible to develop SSR primers with high polymorphism， which can be used in the analysis of B. chinense genetic diversity， germplasm resource evaluation and molecular marker-assisted breeding.CBA22FE2-C5D6-49B5-95BB-86A3709C1060

Key words： Bupleurum chinense DC.; transcriptome; SSR; distribution; sequence characteristics

Foundation items：National System of Chinese Medicinal Materials Industry （CARS-21）;Hebei Technical Innovation System of Traditional Chinese Medicine Industry（HBCT2018060201）;Fundamental Research Funds of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences （2018070203）

0 引言

【研究意义】柴胡（Bupleurum chinense DC.）为伞形科柴胡属多年生草本植物，其根为最常见的大宗药材之一，具有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气的功效。全世界柴胡属植物种类繁多，约有150种，我国有柴胡属植物42种、17变种和7变型（Pan，2006）。《中华人民共和国药典》2020版规定中药柴胡为柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根（国家药典委员会，2020），但由于我国各省区均有柴胡属植物如竹叶柴胡、马尔康柴胡、马尾柴胡等种植，在其产地也作柴胡入药，使得柴胡种源混乱、临床药效难以保证（黄涵签等，2017;石丽霞等，2020）。因此，柴胡不同品种的区分和鉴别显得尤为重要。目前DNA分子标记是鉴定种质资源遗传多样性的重要技术。根据柴胡转录组数据分析柴胡SSR的分布及组成特征，以期开发出多态性高的SSR引物，对柴胡的遗传多样性分析、种质资源评价及分子标记辅助育种等具有重要意义。【前人研究进展】柴胡的研究主要集中在抗肿瘤作用（刘丹和王佳贺，2018）、化学成分（颜美玲等，2018）、基因表达量分析（杨林林等，2019）、复种模式（Liu et al.，2021）等方面，关于SSR分子标记的研究及应用较少。SSR分子标记是一类由1～6个核苷酸为重复单位组成的长度一般不超过200 bp的简单重复序列，在遗传图谱构建、基因定位克隆、品种鉴定、分子标记辅助育种等方面应用较广，是现阶段应用最广泛的分子标记技术之一（He et al.，2003;Wang et al.，2013）。SSR分子标记已在多种药用植物如黄芩（齐琳洁，2015）、苦参（段永红等，2018）、杭白芷（刘倩倩等，2018）、黄芪（刘亚令，2019）、重楼（王海明等，2019）等的遗传多样性研究及育种中得以应用。目前，有关柴胡SSR分子标记的研究及应用方面报道较少。Sui等（2010）构建了北柴胡cDNA文库，对随机挑选的3000多个克隆进行5′端单反应测序，并利用测序结果分析得到86个SSR位点。战晴晴等（2010）从30条ISSR引物和44对SSR引物中分别筛选出28条和14对多态性引物，构建了首张北柴胡遗传图谱，该图谱包含13个连锁群、80个位点，为北柴胡性状基因定位等打下基础。吴素瑞等（2015）从50对柴胡SSR引物中筛选出9对多态性高的引物，获得了供试种质的SSR特征谱带数据，将所有种质分为四大类，证实SSR分子标记可用于柴胡种质鉴别。朱楚然等（2019）对三岛柴胡进行了基因组Survey测序，并对所获得的基因组序列进行了SSR分析，检测到91377条SSR序列，对其中33条SSR序列进行扩增，筛选获得21对有效扩增引物。【本研究切入点】目前可供使用的柴胡SSR分子标记较少，且鲜见转录组SSR的分布及序列特征分析方面的研究报道。虽然杜江等（2015）对柴胡转录组进行全面分析，但对于SSR方面并未深入分析及验证。【拟解决的关键问题】基于高通量测序获得的柴胡转录组数据，深度挖掘转录组SSR位点，并对其在转录组中的分布及序列特征分析进行统计分析，为开发大量多态性良好的SSR分子标记，并用于柴胡遗传多样性分析、种质资源评价及分子标记辅助育种等研究打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为柴胡（Bupleurum chinense DC.）室温（15～20 ℃）保存种子及4 ℃和-20 ℃低温冻融处理12 d的种子，每种处理的种子设置3个重复，共计9个样本，放入液氮迅速冷冻保存备用。

1. 2 转录组测序

将处理过的柴胡种子送至迈维代谢生物科技有限公司，提取总RNA，并进行文库构建及测序工作。测序平台为Illumina HiSeq X Ten高通量测序平台。

1. 3 序列拼接及SSR位点搜索

使用Trinity对柴胡转录组测序Clean reads进行de novo组装，并使用微卫星标记识别工具（MicroSAtellite Identification tool，MISA）（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）对组装得到的所有Unigenes进行SSR位点检测，搜索参数为单核苷酸最少重复10次，二核苷酸最少重复6次，三核苷酸～六核苷酸均最少重复5次。

1. 4 统计分析

以柴胡转录组中SSR位点的重复单元的类型、出现频率、SSR分布的平均距离及其基元组成来分析柴胡转录组SSR的分布及其序列特征。SSR位点的平均分布距離和出现频率相关计算公式：SSR位点的平均分布距离（kb）=总Unigenes的长度/检测到的SSR的总数;SSR的出现频率（%）=SSR数量/Unigenes的总序列数量。

1. 5 SSR引物设计及验证

根据SSR两端互补序列，使用Primer 3.0设计批量引物，引物设计参数：退火温度为57～63 ℃，上、下游引物退火温度相差小于5 ℃;扩增产物长度为100～300 bp;引物GC含量为36%～67%;引物长度为18～22 bp。随机挑选20对引物进行PCR验证，引物由金唯智生物科技有限公司合成。CBA22FE2-C5D6-49B5-95BB-86A3709C1060

2 结果与分析

2. 1 柴胡转录组中SSR出现频率和分布距离分析结果

经Trinity对柴胡转录组数据进行组装，共获得244194条Unigenes序列，其N50值为1036 bp，平均长度791 bp，总长度193138105 bp，GC含量45.39%。依照检索条件检索重复单元长度为1～6 bp的SSR，共鉴定出50303个SSR位点，只以其中的29898个单一型SSR位点为分析对象，其余的20405个复合型SSR位点不作分析。分析发现，柴胡转录组SSR的出现频率为12.24%（表1），平均分布距离6.46 kb，即平均6.46 kb就出现1个SSR位点，说明柴胡转录组中含有大量SSR位点，为后期SSR引物的开发利用提供参考。

2. 2 柴胡转录组中SSR位点的基元类型分析结果

由表1可知，柴胡转录组中SSR位点重复类型丰富，存在单核苷酸～六核苷酸重复基元类型，但重复基元类型之间数量差异较大，其中，主要重复基元类型为二核苷酸，数量最多，有17105个，占SSR总数的57.21%，其次为三核苷酸和单核苷酸，分别占SSR总数的20.75%和20.46%;四核苷酸～六核苷酸重复基元数量均较少;在柴胡转录组SSR中，六核苷酸重复基元的分布距离最高，为5518.23 kb，但出现频率最低，仅为0.01%;二核苷酸重复基元的分布距离最低，仅为11.29 kb，但出现频率最高，为7.00%。总体来说，不同重复基元类型的SSR出现频率和分布距离主要受SSR数量影响，重复基元数越多，其出现频率越高，分布距离越小。

2. 3 柴胡转录组中SSR重复基元碱基组成分析

在柴胡转录组SSR位点中，共有97种基元（已考虑碱基互补、移码等因素），单核苷酸～六核苷酸出现的重复基元分别为2、4、10、29、25和27种（表2）。从出现频率来看，单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复基元为优势的3种重复基元，其不同SSR基元比例如图1所示。单核苷酸重复基元以A/T为主，共6063个，占SSR总数的20.28%，占单核苷酸重复基元数的99.08%。二核苷酸重复基元以AT/AT为主，共9964个，占总SSR总数的33.33%，占二核苷酸重复基元数的58.25%，其次为AC/GT（5072个）、AG/CT（1995个）和CG/CG（74个），分别占SSR总数的16.96%、6.67%和0.25%，分别占二核苷酸重复基元数的29.65%、11.66%和0.43%。三核苷酸重复基元以ATC/GAT为主，共1189个，占SSR总数的3.98%，占三核苷酸重复基元数的19.17%，其次是AAG/CTT （1158个）和AGC/GCT（1044个），分别占SSR总数的3.87%和3.49%，分别占三核苷酸重复基元数的18.67%和16.83%，以ACG/CGT（147个）占SSR总数的比列最低，仅为0.49%，分别占三核苷酸重复基元数的2.37%。四核苷酸重复基元以TATG/CATA （143个）为主，占SSR总数的0.48%。五核苷酸和六核苷酸重复基元出现频率均不高，仅为个位数，占总SSR的比例也很低。

2. 4 柴胡转录组中不同基元重复次数分析结果

柴胡转录组SSR中，重复次数5～10次的SSR位点数量最多，共27942个，占SSR总数的93.46%，其中，重复次数为6次的SSR位点数最高，为7869个，占SSR总数的26.32%;其次是重复次数为7次的SSR位点，共4764个，占SSR总数的15.93%（图2）。单核苷酸重复类型中重复次数最多的是10次，共4201个，而二核苷酸～六核苷酸重复类型的重复次数多集中在5～9次，其中三核苷酸重复基元中重复次数最多的是5次，共3783个，且随着各基元重复次数的增加SSR数量逐渐降低（图2）。

2. 5 柴胡转录组中SSR重复序列长度分析结果

SSR重复序列长度是影响SSR多样性的重要因素，当长度<12 bp时SSR多态性极低（Temnykh，2001）。因此，本研究对序列长度≥12 bp的SSR进行分析，结果（图3）显示，柴胡转录组SSR序列长度存在较大差异，长度范围12～76 bp，平均长度15.28 bp，其中，序列长度12～20 bp的SSR数量最多，共计22656个，占SSR（≥12 bp）总数的达95.28%，且序列长度12 bp的SSR数量最多，共6262个，占SSR（≥12 bp）总数的20.94%;序列长度为21～30 bp的SSR数量为1033个，占SSR（≥12 bp）总数的4.34%;序列长度>30 bp的SSR数量为90个，占SSR（≥12 bp）总数的0.38%。不同重复类型的SSR位點中，四核苷酸的重复序列长度范围最广，为20～76 bp，平均长度为24.73 bp（表1）。

2. 6 柴胡转录组SSR引物的设计及验证

为能更好地使用挖掘的柴胡SSR位点，本研究对29898个SSR位点进行批量设计引物，为了验证设计引物的有效性，随机选取合成了包括二核苷酸重复基元～六核苷酸重复基元的20对引物（表3），分别对甘肃柴胡和冀柴1号进行扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，有14对引物能扩增出清晰且单一条带，引物有效扩增率为70%（图4），其中，10对SSR引物扩增产物长度与预期相符，4对SSR引物扩增产物长度超过预期，表明设计的引物大部分真实可用，且设计的引物在两种柴胡之间可通用，可用于柴胡种质鉴定及遗传多样性等方面的研究。

3 讨论

近年来，随着高通量技术快速发展，测序成本逐渐降低，转录组测序数据涵盖数据量越来越大，转录组学的研究应用越来越广。本研究从柴胡转录组测序获得的244194条Unigenes中共鉴定出单核苷酸重复基元～六核苷酸重复基元6种类型29898个SSR位点，SSR的出现频率为12.24%，平均分布距离6.46 kb。与其他药用植物相比，柴胡转录组SSR的出现频率低于半夏（13.47%）（王森等，2014）、野三七（16.86%）（李翠婷等，2014）、金钗石斛（15.78%）（李清等，2017）、穿心莲（32.36%）（李俊仁等，2018），但明显高于杜仲（2.90%）（黄海燕等，2013）和金铁锁（8.54%）（叶鹏等，2019），存在物种间差异的原因除与物种自身有关外，还可能与SSR搜索标准、转录组中Unigene数量和长度等有关。CBA22FE2-C5D6-49B5-95BB-86A3709C1060

绝大多数植物的SSR位点主要重复基元为二核苷酸和三核苷酸，但不同物种中常见重复基元类型有所不同（王东等，2014）。本研究发现，柴胡SSR中主要重复基元类型为二核苷酸，有17105个，占SSR总数的57.21%;其次为三核苷酸，占SSR总数的20.75%，四核苷酸～六核苷酸所占比例均较小，表明低级基元SSR的多态性普遍高于高级基元（Dreisigacker et al.，2004）。前人研究发现，杜仲（黄海燕等，2013）、党参（王东等，2014）和野三七（李翠婷等，2014）的主要重复基元类型均为二核苷酸，而金铁锁（叶鹏等，2019）和款冬（贺润丽等，2019）的主要重复基元则为三核苷酸。GC含量对于基因的结构和功能具有重要影响，是序列的重要特征之一。GC重复基元在多数植物中出现频率均较低（Sun et al.，2013），如野三七中仅有1个（李翠婷等，2014），党参中仅有5个（王东等，2014），霍山石斛中有73个（洪克前等，2020），本研究从柴胡SSR中鉴定出GC重复基元74个，仅占SSR总数的0.25%，且二核苷酸重复以AT/AT为主，占SSR总数的33.33%;三核苷酸重复以ATC/GAT为主，占总SSR的3.98%，表明柴胡SSR中A/T为优势重复基元。

SSR重复序列长度由基元重复次数和碱基数量决定，是影响SSR多态性的重要因素（Temnykh，2001）。柴胡转录组SSR中，重复次数5～10次的SSR位点数量最多，为27942个，占SSR总数的93.46%，表明柴胡转录组SSR多态性较高。前人研究表明，当SSR序列长度<12 bp时，多态性极低，长度为12～20 bp的SSR多态性中等，长度>20 bp的多态性较高（Temnykh，2001）。本研究柴胡转录组SSR中，序列长度12～20 bp的SSR数量最多，共计22656个，占SSR（≥12 bp）总数的达95.28%;序列长度20 bp以上的SSR数量占SSR总数的4.72%，共1123个，其中，多态性较高的低级重复基元（二核苷酸和三核苷酸）共897个，占79.9%，可用于后续SSR引物的开发。本研究设计的20对引物中，有14对引物能扩增出清晰且单一条带，引物有效扩增率为70%，其中有4对SSR引物扩增产物长度超过预期，原因可能为基因组相对转录组具有内含子，导致其长度变长，也可能是组装错误所导致（Xiang et al.，2015）。

4 结论

柴胡转录组SSR出现频率较高，类型较丰富，具有开发出高多态性SSR分子标记的潜力，将其用于柴胡的遗传多样性分析、种质资源评价及分子标记辅助育种等研究。

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（責任编辑 陈 燕）CBA22FE2-C5D6-49B5-95BB-86A3709C1060