大叶千斤拔活性成分分布及积累动态

牛迎凤等

[摘要] 目的 考察染料木苷、染料木素及大豆苷元在大叶千斤拔植株不同部位分布与积累的动态变化规律。 方法 利用高效液相色谱法，采用C18反相色谱柱，柱温为35℃，以甲醇-0.1%磷酸水溶液（48∶52，V/V）为流动相，检测波长为250 nm，测定和比较不同采收期大叶千斤拔根、茎、叶中染料木苷、染料木素和大豆苷元的含量以及不同生长年限的大叶千斤拔根中三种成分的含量。 结果 染料木苷、染料木素和大豆苷元主要分布于大叶千斤拔根中，且在10月份积累量最高，2月份积累量最低；6.5～7.5年生大叶千斤拔根中这三种成分的含量最高，但从种植成本考虑，3.5年采收比较合适。 结论 根据大叶千斤拔中活性成分的分布与积累规律，发现大叶千斤拔的最佳采收期为10月份，最佳采收年限为三年半，最佳药用部位为根。

[关键词] 大叶千斤拔；染料木素；染料木苷；大豆苷元；分布；积累动态

[中图分类号] R282.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）10（a）-0017-04

Distribution and accumulative dynamic variation of bioactive components in Moghania macrophylla

NIU Yingfeng LI Xiaohua LI Haitao ZHANG Zhonglian GUAN Yanhong ZHANG Lixia▲

Key Laboratory of Dai and Southern Medicine of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture， Yunnan Branch of Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Yunnan Province， Jinghong 666100， China

[Abstract] Objective To investigate the content and dynamic distribution of three active ingredients include genistein， genistin and daidzin in Moghania macrophylla. Methods The HPLC method was adopted， the chromatograph column was C18 spincolumn and the column temperature was 35℃， the mobile phase was methanol-0.1% phosphoric acid （48∶52， V/V）， and the detection wavelength was 250 nm. The content of genistin， genistein and isoflavoues aglycone in the root， steem and leaf of Moghania macrophylla which harvested in different periods were determinated， the content of the three active ingredients in the root of Moghania macrophylla which harvested in different year were determinated. Results The three active ingredients were mainly distributed in the root of Moghania macrophylla， the accumulation content of the three active ingredients were the highest in October and lowest in February， for different growth ages， the contents of the three active ingredients were the highest in the root of Moghania macrophylla which were 6.5-7.5 years old， but the 3.5 years old Moghania macrophylla was more appropriate for harvest when considering the plant cost. Conclusion According to the distribution and accumulative dynamic variation of bioactive components in Moghania macrophylla， the optimal harvest time is October， the best growth age is 6.5 years old and the best medicinal part is the root.

[Key words] Moghania macrophylla； Genistein； Genistin； Isoflavoues aglycone； Distribution； Dynamic accumulation

千斤拔作为我国传统的重要中药之一[1]，是豆科植物大叶千斤拔[M. macrophylla（Willd.） O. Kuntze]、蔓性千斤拔[M. philippinensis（Merr. et Rolfe）Li.]及绣毛千斤拔[M. ferruginea （Wall. ex Benth.）Li.]的干燥根[2-4]，具有祛风除湿，舒筋活络、强筋壮骨、消炎止痛、活血解毒等功效[5-7]，临床上常用于治疗风湿骨痛、腰肌劳损、气虚脚肿、劳伤久咳、咽喉肿痛等[8-9]，具有较高的药用和食用价值。千斤拔属植物主要分布于我国云南、贵州、广东、广西等南方省区，是西双版纳傣族民间和傣医临床上的传统傣药材[10]。因其重要的药用价值及较大的市场需求，导致野生药材资源逐渐匮乏，目前临床使用的千斤拔类药材主要以种植为主，而云南省内种植最多的则是大叶千斤拔。因此本研究以大叶千斤拔为材料，对其有效成分在不同药材部位的分布规律及不同生长年限与采集月份的积累动态进行研究。

前人通过化学成分预分析推测，大叶千斤拔的主要成分包括糖类、苷类、黄酮类、鞣质、酚类、氨基酸、甾体、皂苷、有机酸、生物碱、挥发油、蒽醌类化合物等[11-12]。作为蝶形花科植物，异黄酮类化合物在千斤拔类药材中的含量非常丰富[13]，且是其药材的主要化学成分，而染料木素则是其异黄酮类化合物中含量最高的成分[14-16]，也是大叶千斤拔中活性最高的化合物[17]。根据近年来的相关研究报道，染料木素可防治一系列常见疾病，包括：前列腺癌、乳腺癌、妇女更年期综合征及心脑血管疾病[18]，这与千斤拔药材的药效极为一致，因此可推测染料木素与其异黄酮类化合物应是大叶千斤拔药材的主要药效成分。然而，异黄酮类成分的积累动态及其在大叶千斤拔体内的分布状况尚不明确。本研究对大叶千斤拔中异黄酮类物质在不同生长期及不同生长年限的积累动态进行了研究，同时对异黄酮类物质在大叶千斤拔叶、茎、根几个不同部位的分布进行了分析，以期为大叶千斤拔药材原料质量的稳定控制提供参考，同时对云南种植的大叶千斤拔合理采收及进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

分别在2014年8、10、12月，2015年2、4、6月这6个不同生长时期，采收西双版纳州勐海县试验田种植的3～4年生大叶千斤拔6批，每批10株，每批样品又分为根、茎、叶三份。

2015年12月，分别采集西双版纳州勐海县试验田种植的1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5年生的大叶千斤拔共7批样品，每批样品10株，取根备用。

所采样品经张丽霞副研究员鉴定为豆科植物大叶千斤拔[M. macrophylla （Willd.） O. Kuntze]的全株。

1.2 仪器和试剂

Waters 600型高效液相色谱仪（美国Waters公司），PL203电子天平（美国Mettler Toledo公司，感量：0.001 g），AB135-S电子天平（美国Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg）。

染料木苷、染料木素和大豆苷元对照品购自广州泛宏贸易有限公司，含量为98%；

无水乙醇为分析纯，甲醇为色谱纯，水为超纯水（经0.45 μm微孔滤膜过滤）。

1.3 标准溶液的制备

精密称取对照品染料木苷1.01 mg，大豆苷元1.05 mg，染料木素1.18 mg，用甲醇配制成储备溶液，浓度分别为1.01、1.05、1.18 mg/mL。使用时，再根据需要稀释成相应浓度的对照品溶液。

1.4 样品溶液的制备

大叶千斤拔样品晾干后，粉碎过60目筛，取样品粉末，精密称定3份，每份5 g，置于250 mL平底烧瓶中，加入100 mL 80%乙醇，称定并记录重量。80℃的温度下，水浴回流法提取3.5 h，静置至室温，再称定重量，用提取溶液补足减失的重量，摇匀后过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.5 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇和0.1%磷酸水溶液的比例为48∶52（V/V）；流速为1.0 mL/min；检测波长250 nm；柱温35℃；进样量为20 μL。

1.6 方法学考察

1.6.1 标准曲线及线性范围 取储备对照品溶液，配制成染料木素0.0059 mg/mL，染料木苷0.0505 mg/mL，大豆苷元0.000 525 mg/mL的混合对照品溶液1和染料木素0.0472 mg/mL，染料木苷0.126 mg/mL，大豆苷元0.002 63 mg/mL的混合对照品溶液2。取1号和2号混合对照品溶液，分别进样18、14、10、6、2 μL，测得各峰面积。以对照品质量（μg）为横坐标（x），峰面积积分值为纵坐标（y），绘制得到两条标准曲线。

1.6.2 精密度试验 按照样品溶液制备方法，制备一份样品溶液，在上述色谱条件下，精密吸取20 μL，连续进样6次，测定三种活性成分峰面积。染料木苷、染料木素和大豆苷元的峰面积RSD分别为1.42%、1.28%、1.65%，表明精密度良好。

1.6.3 稳定性试验 按照样品溶液制备方法，制备一份样品溶液，在上述色谱条件下，每隔2 h测定一次，结果表明三种活性成分在24 h内稳定。染料木苷、染料木素和大豆苷元的峰面积RSD分别为1.26%、1.49%、2.03%。

1.6.4 重复性试验 取同一批大叶千斤拔样品粉末，平行6次取样，制备样品溶液，在上述色谱条件下，进样20 μL，测定三种活性成分的峰面积。染料木苷、染料木素和大豆苷元的峰面积RSD分别为3.45%、2.81%、3.02%，表明重复性良好。

1.6.5 加样回收率试验 精密配制染料木苷对照品溶液（1.33 mg/mL），染料木素对照品溶液（1.04 mg/mL）和大豆苷元对照品溶液（0.00715 mg/mL）。采取加样回收法，平行称取已知含量的样品粉末9份，分为3组，每份样品2.5 g。分别向3组样品中精密加入对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，然后制备样品溶液。在上述色谱条件下，进样20 μL，测定各色谱峰峰面积，染料木苷、染料木素和大豆苷元回收率的RSD均小于2%，表明该方法准确度较高。

2 结果

2.1 不同生长期样品测定结果

精密称取不同生长期的样品粉末各5 g，按样品溶液制备项方法制备样品溶液，平行测定3次，结果见表3。以不同生长期为横坐标，三种异黄酮成分的含量总和为纵坐标作图。见图1。

由图1可以看出，不同生长期的大叶千斤拔中三种异黄酮类化合物的含量差异不大，总体来看，10月份的含量最高，8月和12月次之。大叶千斤拔不同部位中三种异黄酮类化合物的含量差异较大，根中异黄酮类成分的含量明显高于茎和叶。

2.2 不同生长年限样品测定结果

精密称取不同生产年限大叶千斤拔的根粉末各5 g，按样品溶液制备项方法制备样品溶液，平行测定3次，结果见表4。因大豆苷元只在6.5年的大叶千斤拔根中测得，故不作考虑。以不同生长年限为横坐标，染料木苷和染料木素的含量为纵坐标作图。

从图2可以看出，不同生长年限的大叶千斤拔中染料木素和染料木苷的含量发生明显变化。染料木苷和染料木素的含量前3年缓慢增加，第4年稍有回落，第5年之后又逐步增长。

3 讨论

本研究首次系统研究了大叶千斤拔中异黄酮类成分的周年积累规律，根据本研究可以初步推断，大叶千斤拔目前采用的8～10月的采收时间较为合理，其中10月最为理想。此外，12月也可进行采收。

本研究对大叶千斤拔中异黄酮类成分在不同植株部位的分布规律进行了系统研究，发现大叶千斤拔的传统药用部位选用根是比较合理的，尽管其茎和叶中也有一定量的异黄酮类化合物，但是含量较低，不建议替代根入药，但可考虑用作饲料或其他用途。

对1.5～7.5年生不同生产年限的大叶千斤拔根中染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量测定和分析发现，6.5～7.5年生大叶千斤拔根中上述三种活性成分的含量最高，但总体而言3.5年采收较为适宜，此时采收既不会造成过高的种植和管理成本，又可保证药材中有较高的异黄酮类活性成分含量。

目前，千斤拔类药材被广泛用于妇科、风湿痹痛等类型的中成药生产，如金鸡胶囊、补血调经片、妇科千金片、壮腰健肾丸和千斤拔饮等中成药[10]，对治疗乳房疾病、跌打损伤、妇科病、慢性肾炎、牙痛、食欲不振和病后气虚均有良好效果[20]；此外，对急性乳腺炎、白细胞减少症及软组织损伤及感染，千斤拔的治疗效果也较佳[21]；并且，我国民间及中医临床有采用千斤拔治疗各类疾病的有效单验方，包括毒蛇咬伤、各种肿毒、急性咽喉炎、风湿骨疼、产后关节疼痛及妇女白带过多等，均有较好的疗效[22]，说明千斤拔类药材的用途极其广泛，市场对千斤拔类药材的需要将持续旺盛。因此，今后应对其进行全面深入研究，以保障千斤拔类药材原料质量的可靠性和可控性，促进千斤拔类药材的进一步开发利用。

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（收稿日期：2016-06-20 本文编辑：赵鲁枫）