AFB1降解菌的分离鉴定、降解条件优化及降解产物毒性评估

邓盾　唐嘉虹　王永飞　马现永

鄧盾（1985-），博士，副研究员，加拿大麦吉尔大学访问学者，主要从事微生物降解养殖环境有害物质研究工作，在黄曲霉毒素生物降解、养殖臭气生物防控及养殖废弃物无害化处理等方面取得了一系列进展。目前已主持国家自然科学基金、广东省自然科学基金、广州市科技计划等项目7项。以第一作者或通讯作者在《Journal of Hazardous Materials》《Chinese Journal of Catalysis》《南方农业学报》《微生物学通报》等国内外期刊上发表学术论文25篇（SCI收录12篇）;以第一完成人获得授权国家发明专利4项，国际发明专利1项;获得广东省农业技术推广奖一等奖1项、广东省农业科学院科技进步奖二等奖1项;担任全国饲料行业质量安全监督专家，以及广东省、广州市、河源市、清远市和南雄市农村科技特派员。

摘要：【目的】从土壤样品中筛选能降解黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁，AFB₁）的菌株，并研究其对AFB1的降解性质及抑制黄曲霉菌能力，评估其作为微生物降解AFB₁制剂的潜力，为进一步开发AFB₁脱毒剂提供参考依据。【方法】以香豆素为唯一碳源，筛选出1株高效的AFB₁降解菌，通过16S rRNA基因测序得知菌株所属种属，并利用高效液相色谱确定菌株降解AFB1的特性，通过单因素试验优化该菌株降解AFB₁的效率，共培养分析其对黄曲霉菌的抑制作用，最后利用SOS显色反应评估菌株对AFB₁的脱毒效果。【结果】通过液相色谱检测，获得1株菌株GDAAS003对AFB₁的降解率相对较高，其16s rRNA基因序列与链霉菌Streptomyces cerasinus SR3-134（LC128347.1）的相似性高达100%，菌株降解AFB₁的活性物质主要存在于上清液中，可能为胞外酶。GDAAS003上清液降解AFB₁的最佳pH为8.0的磷酸盐缓冲液，最适反应温度为30 °C。经优化，菌株GDAAS003上清液对50 ng/mL AFB₁96 h的降解率可达90.50%，对100 ng/mL AFB1 96 h的降解率为75.68%。对降解产物的遗传毒性进行检测，结果表明菌株GDAAS003降解AFB₁的产物未表现出毒性，同时GDAAS003能抑制玉米中黄曲霉菌合成AFB₁。【结论】链霉菌GDAAS003既能以较高的降解效率降解AFB₁，又能抑制黄曲霉菌的生长，其在食品和饲料行业中有较大的商业应用前景。

关键词：黄曲霉毒素B₁;链霉菌;生物降解;SOS显色反应

中图分类号： S859.87                        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）03-0596-11

AFB1 degrading bacteria： Isolation，identification，optimization of its degradation conditions and toxicity evaluation of its degradation products

DENG Dun TANG Jia-hong WANG Yong-fei MA Xian-yong

（1 Institute of Animal Science， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding/Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China， Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition/Guangdong Engineering Technology Research

Center of Animal Meat Quality and Safety Control and Evaluation， Guangzhou， Guangdong  510640， China;

2Department of Bioengineering，Jinan University， Guangzhou， Guangdong  510632， China）

Abstract：【Objective】In order to solve the problem of aflatoxin B₁（AFB₁） contamination in feed and food，an AFB₁-degrading strain was screened from soil samples and its capacities for degradation of AFB₁and inhibition of Aspergillus flavus growth were studied. 【Method】Using coumarin as the sole carbon source，an efficient AFB₁degrading strain was selected. The species of the strain were identified by 16S rRNA gene sequencing and its degradation characteristics of AFB₁were studied by High performance liquid chromatography（HPLC）. The degradation efficiency of GDAAS003 on AFB₁was optimized by single factor experiment，and the inhibition effect of GDAAS003 on A. flavus growth was analyzed by co-culture. Finally，the SOS-Chromotest was used to evaluate the detoxification of AFB₁by the strain. 【Result】Through HPLC detection，a highly efficient AFB₁-degrading strain was selected. 16S rRNA analysis showed that the sequence of GDAAS003 was 100% homologous to that of Streptomyces cerasinus SR3-134（LC128347.1），and that the AFB₁degradation activity was extracellular and enzymatic. The results showed that the optimum pH of supernatants to degrade AFB₁was 8.0 in Na2HPO4/NaH2PO4 buffer and that the optimum temperature was 30 °C. Under the optimized condition，the degradation rate of 50 and 100 ng/mL AFB₁in 96 h of strain supernatant was 90.50% and 75.68%，respectively. Moreover，the genotoxicity test results of the degradation products showed that the degradation products did not show genotoxicity. In addition，GDAAS003 could inhibit AFB₁synthesis by A. flavus in maize. 【Conclusion】Streptomyces GDAAS003 not only degraded AFB₁with high efficiency，but also inhibited the growth of A. flavus. It has a great application prospect in the food and feed industries.B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

Key words： aflatoxin B₁; Streptomyces sp.; biodegradation; SOS Chromotest

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（C31802103）; Low Carbon Agriculture and Carbon Neutralization Research Center， GDAAS Project（XTXM202204）; Guangzhou Livelihood Science and Technology Project（201903010083）; Agricultural Competitive Industry Discipline Team Building Project of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（202118TD）

0 引言

【研究意义】霉菌毒素（Mycotoxins）是由霉菌在谷物生长繁殖过程中或饲料生产过程中产生的有毒次级代谢产物，霉菌毒素污染范围广，毒性强。由于被污染的粮食和饲料无法食用，因而每年均有大量受霉菌污染的粮食和饲料被浪费。据联合国粮食及农业组织统计，每年全世界约有25%的农作物受到霉菌毒素的污染，其中2%的粮食因此无法食用。在一些产品中霉菌毒素检出的污染率高达90%，其中严重污染高达15%～25%（殷传振，2015）。霉菌毒素已对人体和动物健康构成了严重危害，其中黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是危害最大的一类。目前已知的黄曲霉毒素有20余种，主要由香豆素环和呋喃环组成。不同的黄曲霉毒素毒性有所不同，其毒性由强至弱依次为AFB₁>AFM₁>AFG₁>AFB₂>AFM₂>AFG₂，在这些物质中AFB1的毒性和致癌性最强，其结构中含有8，9-环氧基团，与DNA结合能力强，从而抑制转录，引起癌症的发生（谢晓鹏等，2013）。AFB₁还会导致畸形和生殖系统、免疫系统疾病，因此1993年国际癌症研究机构将黄曲霉毒素归为I类人类致癌物（李智高等，2019）。如何控制黄曲霉毒素污染对于减少农业经济损失和保障食品安全均十分重要。【前人研究进展】目前，AFB₁的脱毒方法主要包括物理法、化学法和生物降解法。其中，物理脱毒方法有吸附法（Lewis et al.，2005）、超声法（Raters and Matissek，2008）、加热法（Haque et al.，2020）等，化学脱毒方法有臭氧氧化法（Bovo et al.，2015）、氨化法（Liu et al.，2019）等。但这些方法不仅效率较低，成本不符合商业化的要求，还会破坏营养和矿物质元素吸收，要求脱毒剂需具有更高的降解效率和生物安全性（Zorlugenc et al.，2008）。近年来微生物降解为霉菌毒素脱毒提供了一种新思路。研究表明一些真菌和细菌能有效去除AFB₁。在真菌降解AFB₁的研究中，最著名的是假蜜環菌（Armillariella tabescens），其合成的胞内黄曲霉毒素解毒酶，在pH 6.0和28 ℃条件下比酶活为7.09 nmol/（mg·min）（Weng et al.，1994）。此外，平菇（Pleurotus ostreatus）（Liu et al.，2001）、云芝（Trametes versicolor）（Elias-Orozco et al.，2002）、白腐真菌（Phanerochaete sordida）（Verheecke et al.，2016）等真菌也有降解AFB₁的能力。但真菌不易培养，且降解AFB1的时间长，限制了其在食品和饲料工业中的应用。细菌中可降解AFB₁的种属很多，如地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）（王宁等，2008）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（Alberts et al.，2009）、庞帝杆菌（Pontibacter）（Farzaneh et al.，2012）、红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）（周露等，2014）、枯草芽孢杆菌（B. subti-lis）（Dellafiora et al.，2017）、梭形赖氨杆菌（Lysinibacillus fusiformis）（Xu et al.，2017）、施氏假单胞菌（P. stutzeri）（Shu et al.，2018）等均具有降解AFB₁的能力。但出于安全性考虑，部分菌株不能应用于生产实际中如铜绿假单胞杆菌（Rao et al.，2017），还有部分菌株受降解效率的制约（Alberts et al.，2006），影响其应用。因此，筛选高效安全的AFB₁降解菌株是急待解决的问题。链霉菌是研究者考虑的微生物之一。Cserháti等（2013）研究发现链霉菌AS1对黄曲霉菌有竞争和拮抗作用，并能控制花生中AFB₁的污染。Sangare等（2014）比较了8种不同链霉菌作为抗AFB₁和AFB2生防剂的可能性，提出链霉菌作为微生态制剂具有较高的生物安全性。Eshelli等（2015）比较了Streptomyces lividans TK24和S. aureofaciens ATCC10762对AFB₁的降解作用，发现这2种菌的上清液对AFB₁分别有86%和88%的降解率（24 h）。Harkai等（2016）系统比较了124株链霉菌对AFB₁的降解作用，通过SOS-Chromotest试验发现10种链霉菌能缓解AFB₁引起的细胞毒性，其活性物质主要存在于上清液中，但其AFB₁降解效率（1.0%～88.3%）差异很大。研究表明，链霉菌中含有一种特殊的低电位辅因子F420，这种辅因子有利于AFB₁中双键的还原（Yang et al.，2014）。【本研究切入点】目前能用于生产实践中的链霉菌制剂很少，尤其是具有降解AFB₁功能的防控菌株，亟待开发具有较高生物安全边际和较高降解效率的链霉菌制剂。【拟解决的关键问题】从土壤中分离筛选出具有AFB₁降解能力的菌株，通过AFB₁降解试验评估其降解能力，并采用SOS-Chromotest试验评估其代谢产物的遗传毒性，为进一步开发AFB1脱毒剂提供参考依据。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试剂：AFB₁标准品购自上海佰晔生物科技中心，蛋白酶K和十二烷基硫酸钠（SDS）购自生工生物工程（上海）股份有限公司;色谱级乙腈和甲醇购自上海阿拉丁试剂有限公司;细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，SOS-Chromo Test Kit购自加拿大环境生物检测产品有限公司。AFB₁在使用前配制成贮备液的形式：5 mg标准品加入50 mL色谱甲醇中，制成500 ng/mL AFB₁贮备液。

培养基：MSM培养基：参照闵勇等（2016）的方法配制，称取KH₂PO₄0.5 g、NH₄NO₃2.0 g、CaCO₃2.0 g、MgSO₄·7H2O 0.5 g、FeSO4 20 mg，用超纯水定容至1 L，调pH至7.0，加琼脂粉20 g，121 ℃下高压灭菌20 min后，加入香豆素0.1 g;LB培养基：称取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g，用超纯水定容至1 L，调pH至7.2，121 °C下高压灭菌20 min;马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）：称取去皮马铃薯200 g，切成小块，加超纯水浸没马铃薯，沸水煮30 min，纱布过滤马铃薯浸出液，加葡萄糖20 g，超纯水定容至1 L，pH自然，121 °C下高压灭菌20 min。

1. 2 菌株分离、纯化与鉴定

香豆素具有氧杂萘邻酮结构，且致毒性远小于AFB₁，因此常利用香豆素为唯一碳源进行AFB₁降解菌株的筛选。将采集到的广州市天河区五山街道鸡笼山附近森林土壤样品梯度稀释后，接种于含有0.01%香豆素的MSM培养基中，挑出单菌落在LB培养基中分离纯化，使用LB液体培养基扩繁菌株，提取细菌的DNA。使用27F：5'-GAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'和1492R：5'-GTTACCTTGTTACGACT-3'扩增16S rRNA。扩增程序：95 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，进行32个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，委托北京擎科生物科技有限公司测序，将测序结果提交至NCBI进行比对。将纯化的菌株使用LB固体培养基划线培养，挑单克隆菌落于MSM液体培养基中，加入AFB₁至终浓度为100 ng/mL，200 r/min反应24 h，并测定剩余的AFB₁浓度，筛选出降解能力较强的菌株。

1. 3 AFB1检测方法

向1.0 mL AFB₁反应体系中加入5.0 mL乙腈和水的混合液（乙腈∶水=84∶16，体积比）及1.0 mL正己烷，充分振荡混匀，静置1 h。制备液相样品：通过注射器吸入200 μL静置后的溶液，经0.22 μm聚偏氟乙烯滤膜过滤至进样瓶中，再利用高效液相色谱—光化学衍生—荧光检测法（HPLC-PHR-FLD）检测AFB₁含量。色谱条件：色谱柱为XBridgeTM C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样量20 μL，流动相为甲醇∶水∶乙腈=35∶10∶55（体积比），流速1 mL/min，柱温30 ℃，荧光激发光波长360 nm，发射光波长440 nm（Adebo et al.，2016）。

1. 4 分离菌株降解AFB₁性质

1. 4. 1 AFB₁降解活性部位 挑单克隆菌株接种于LB培养基中，30 ℃、170 r/min摇床振荡过夜培养，制备AFB₁降解菌株上清液、细胞内容物和细胞碎片的反应样品。上清液反应样品：取10.0 mL菌液于4 ℃、12000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm水系滤膜过滤待用。细胞内容物反应样品：离心后的菌体经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，再离心，取菌体加入10.0 mL PBS重悬后，冰浴超声波15 min（400 W，超声波5 s，间隔5 s），破胞后的液体于4 °C、12000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm水系滤膜过滤待用。细胞碎片反应样品：上述破胞离心后得到的沉淀用10.0 mL PBS重悬浮起来待用。反应体系：分别取400 μL上述3种待用液和100 μL AFB₁贮备液于15 mL玻璃管中，补无菌水至1.0 mL。在玻璃管中进行生物降解试验，分别测定其对AFB₁的降解作用，整个反应体系为1.0 mL，后置于37 ℃避光反应24 h，HPLC测定AFB₁的剩余量。使用LB培养基作上清液组的对照，PBS作细胞裂解液组的对照。反应结束后，如1.3所述，使用甲醇和乙腈作为溶剂，提取未反应的AFB₁。

1. 4. 2 蛋白酶K和变性处理对分离菌株上清液降解AFB₁的影响 为确定热处理或蛋白酶K对AFB₁降解能力的影响，在开始AFB₁降解反應之前，用不同方法处理上清液之后再加入AFB₁贮备液。37 °C、170 r/min摇床振荡过夜培养降解菌株，菌液离心去沉淀，取上清液过0.22 μm滤膜后备用。3组变性处理具体方法如下：（1）加入蛋白酶K处理。1 mg/mL蛋白酶K加入到上清液中，37 oC处理1 h，加入0.4 mL AFB₁贮备液至1.6 mL经蛋白酶K处理的上清液中，反应在15 mL玻璃管中进行;（2）加入1% SDS（w/v）处理。1% SDS加入到上清液中，37 oC处理6 h，加入0.4 mL AFB₁贮备液至1.6 mL经SDS处理的上清液中，反应在15 mL玻璃管中进行;（3）加热处理。将上清液煮沸30 min，用滤膜过滤，向1.6 mL过滤的上清液中加入0.4 mL AFB₁贮备液，反应在15 mL玻璃管中进行。分别在30 ℃黑暗中放置24 h，以无菌LB培养基和未经处理的上清液作对照。反应结束后，如1.3所述，使用甲醇和乙腈作为溶剂，提取未反应的AFB₁。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

1. 4. 3 温度对分离菌株上清液降解AFB₁的影响 为研究温度对上清液降解效率的影响，使用过滤灭菌的上清液进行AFB₁降解温度条件的优化。将反应体系分别置于4、10、20、30、37和50 oC处理24 h，反应中将缓冲液与上清液按照4∶1混合，取400 μL混合液加入100 μL AFB₁贮备液（500 ng/mL），补无菌水至1.0 mL，以15 mL玻璃管为反应容器，置于不同温度下避光反应24 h。

考虑到变性蛋白等因素会对AFB₁产生非特异性吸附，除AFB₁外所有成分在不同温度下处理24 h后，12000 r/min离心5 min，弃上清液，收集变性蛋白，加入1.0 mL无菌水和AFB₁，在不同温度下反应24 h，以排除非特异性吸附。

1. 4. 4 pH对分离菌株上清液降解AFB₁的影响 为研究pH对上清液降解效率的影响，使用过滤除菌的上清液进行AFB₁降解的pH条件优化。使用50 mmol/L不同pH的缓冲液研究pH对降解率的影响，其中柠檬酸盐缓冲液pH为4.0～6.0，磷酸盐缓冲液pH为6.0～8.0，Tris盐酸缓冲液pH为8.0～9.0。反应中将酶液与缓冲液按照4∶1混合，取400 μL混合液加入100 μL AFB₁贮备液，补无菌水至1.0 mL，以15 mL玻璃管为反应容器。置于最适反应温度下避光反应24 h。按照1.4.3的方法计算非特异性吸附的AFB₁含量。

1. 4. 5 金属离子对分离菌株上清液降解AFB1的影响 为防止金属离子在碱性条件下形成沉淀，使用pH 6.5的缓冲液配制50 mmol/L的Cu²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺和Fe²⁺（分别为CuCl₂、MgCl₂、FeCl₃、ZnCl₂、CaCl₂、MnCl₂和FeCl₂）金属离子溶液，过滤灭菌。反应中将上清液与金属离子溶液按照4∶1混合，取400 μL混合液加入100 μL AFB1贮备液，补无菌水至1.0 mL，以15 mL玻璃管为反应容器。置于最适反应温度下避光反应24 h，以LB培养基和未经处理的分离菌株作对照。反应结束后，如1.3所述，使用甲醇和乙腈作为溶剂，提取未反应的AFB1。

1. 4. 6 反应时间和浓度对分离菌株上清液降解AFB₁的影响 在最适的反应温度和反应pH条件下，比较50、100、250、500和1000 ng/mL 5个AFB₁浓度下的AFB₁降解效率，分别避光反应12、24、48、72和96 h。反应结束后，如1.3所述，使用甲醇和乙腈作为溶剂，提取未反应的AFB₁。

1. 5 SOS显色反应试验

参照Fata等（2017）的方法，使用SOS显色试剂盒对AFB₁和降解产物的遗传毒性进行评估。将大肠杆菌PQ37按照1∶100接种于LB培养液37 ℃振荡培养过夜（8～12 h），用10%二甲基亚砜（DMSO，内含0.85%氯化钠）溶液将细菌悬浮液稀释到OD600值为0.05～0.06。阳性参照物为直接遗传毒性化合物4-硝基喹啉氧化物（4NQO，10 μg/mL），LB培养基为空白。

试验比较3个样品的遗传毒性，分别为未降解的AFB₁（阳性对照）、大肠杆菌K12降解的AFB₁（阴性对照）和分离菌株上清液降解的AFB₁。3组反应体系中AFB₁的初始浓度均为100 μg/L，反应体系10.0 mL，反应时间48 h，最终浓缩收到1.0 mL甲醇中，取10 μL与等体积的肝脏微粒体酶（SOS显色反应试剂盒中的S9组分）混合，用于后续毒性评估试验。取以上3种被测化合物、4NQO和LB培养基各10 μL，加入96孔微型板中，加入100 μL OD600=0.05的大肠杆菌K12突变体PQ37，将96孔板置于37 ℃恒温培养箱中孵育2 h;随后将100 μL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）和对硝基苯磷酸盐（pNPP）加到孔板中，将96孔板进一步孵育1.5 h;再使用酶标仪于405和620 nm处测量β-半乳糖苷酶（β-Gal）和碱性磷酸酶（AP）的底物相对浓度，根据公式计算出指示遗传毒性的诱导因子（Induce factor，IF）：

IF= A_{405 nc}×A_{620 t}/A_{405 t}×A_{620 nc}

式中，nc为空白对照，t为测试样品。IF≥1.5被认为具有遗传毒性。

1. 6 分离菌株对黄曲霉菌Aspergillus flavus CGMC C3.4409的抑制效果

將AFB₁产生菌株A. flavus CGMCC3.4409和分离菌株分别接种于PDB培养基和LB培养基中，30 ℃下170 r/min培养48 h备用。向培养皿中加入5 g干燥玉米粉和10.0 mL无菌水充分混匀，分别接入1.0 mL分离菌株上清液、灭活的上清液作为对照组;接入1.0 mL未灭活的分离菌株上清液和1.0 mL A. flavus CGMCC3.4409菌液，1.0 mL灭活的分离菌株上清液和1.0 mL A. flavus CGMCC3.4409菌液作为保护组;接入1.0 mL LB培养基和1.0 mL A. flavus CGMCC 3.4409菌液作为感染组。所有处理组样品于30 ℃避光静置反应72 h后，加入5.0 mL甲醇振荡摇匀20 min并静置20 min，取分离菌株的上清液过滤后，用HPLC检测AFB₁含量，通过绘制的标准曲线Y=9.6×10⁷X+1146929计算比较分离菌株上清液对A. flavus CGMCC3.4409的抑制效果。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

1. 7 安全注意事项

AFB1是一种致癌化合物，在使用AFB₁时，为安全起见，戴上手套、护目镜和一次性口罩。此外，用于标准品和溶液配制的玻璃器皿在清洗前用3%次氯酸钠水溶液浸泡以消除AFB₁残留。与AFB₁有关的标准溶液和分析工作受到避光保护。

1. 8 统计分析

AFB₁降解率（%）=（对照组AFB₁含量-实验组AFB₁含量）/对照组AFB₁含量×100

所有试验均设3次重复，采用GraphPad Prism 5.0处理分析试验数据和作图，统计方法采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 AFB₁降解菌株的分离鉴定结果

试验选用香豆素平板富集、分离菌株，最终成功分离出多株菌株。通过液相色譜检测发现其中一株菌株GDAAS003对AFB₁的降解率相对较高。根据16s rRNA测序结果，构建GDAAS003的系统发育进化树（图1），显示菌株GDAAS003与链霉菌Streptomyces cerasinus SR3-134（LC128347.1）属于同一分支，核苷酸一致性高达100%，由此判断菌株GDAAS003为链霉菌，将其命名为S. cerasinus GDAAS003。

2. 2 AFB₁降解活性物质存在部位

比较菌株GDAAS003上清液、细胞内容物和细胞碎片对AFB₁的生物降解作用，结果如图2所示，菌株GDAAS003不同部位的AFB1降解率在3.83%～53.67%，其中GDAAS003上清液对AFB₁的降解能力最强，极显著高于细胞内容物（5.70%）和细胞碎片（3.83%）的降解率（P<0.01，下同）。由此确定该菌对AFB₁的降解活性物质主要存在于胞外上清液中。

2. 3 蛋白酶K和变性处理对菌株GDAAS003上清液降解AFB₁活性的影响

通过不同方法处理后，降解菌株GDAAS003的上清液对AFB₁的降解结果如图3所示。由图可知，物理变性（加热）、化学变性（SDS）和生物变性（蛋白酶K）均会影响菌株GDAAS003上清液对AFB₁的降解率，其中经加热处理的上清液对AFB₁的降解率为2.83%，较未处理的上清液极显著降低50.84%;经SDS处理的上清液对AFB₁的降解率为11.07%，较未处理的上清液极显著降低42.67%;经蛋白酶K处理的上清液对AFB₁的降解率为15.7%，较未处理的上清液极显著降低37.97%。可见3组处理均明显抑制上清液对AFB₁的降解活性。综合以上现象判断，菌株GDAAS003降解AFB₁的反应可能为酶促反应，上清液中对AFB₁起主要降解作用的活性物质很有可能是胞外酶蛋白。

2. 4 菌株GDAAS003上清液降解AFB₁条件的优化

2. 4. 1 温度对上清液降解AFB₁活性的影响 不同温度条件下，菌株GDAAS003的上清液对AFB₁的降解结果如图4所示。温度在4～50 ℃范围内递增时，上清液的AFB₁降解率呈先升高后降低的变化趋势，在30 oC时达最大值，为59.76%，而在4 ℃时降解率最低，为21.21%。同时，研究发现不同热处理下上清液产生的沉淀也会发生一定程度的降解AFB₁作用，当温度从4 ℃升至37 ℃时，变化差异不显著（P>0.05），且降解率（1.07%～2.22%）较小;但当温度达50 ℃时，会使上清液中产生较多的白色沉淀，测得的AFB₁降解率达10.17%，推测变性蛋白对AFB₁产生了部分吸附作用。但与上清液的总AFB₁降解率相比，变性蛋白对AFB₁的作用相对较小。综合以上现象可知，菌株GDAAS003上清液降解AFB₁的最适反应温度为30 ℃。

2. 4. 2 pH对上清液降解AFB₁活性的影响 不同pH条件下，菌株GDAAS003的上清液对AFB₁的降解结果如图5所示。pH在4.0～8.0的范围内，AFB₁降解率随之显著增加（P<0.05，下同），在pH 8.0时达最大值（65.33%）;pH从8.0进一步上升到9.0时，AFB₁降解率显著降低;pH 4.0的降解率最低，仅为0.83%。此外，试验发现变性蛋白对AFB₁的降解作用非常微弱;随着pH的变化，降解率为0.16%～3.93%，降解率未呈现出明显的变化趋势。综合以上现象可知，菌株GDAAS003上清液降解AFB₁的最佳pH条件为8.0的磷酸盐缓冲液。

2. 4. 3 金属离子对上清液降解AFB₁活性的影响 7种金属离子分别参与反应的条件下，菌株GDAAS003的上清液对AFB₁的降解结果如图6所示。除Mg2+外，其他6种金属离子对上清液的AFB₁降解活性均有不同程度的抑制作用，其中抑制作用最强的是Ca2+。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

2. 4. 4 反应时间和浓度对AFB₁降解率的影响 比较0～96 h菌株GDAAS003上清液对50～1000 ng/mL AFB₁的降解效率，结果（图7）显示，0～24 h降解率增加最快，其中初始浓度为50 ng/mL的反应体系在24 h时降解率可达65.33%。但随着AFB₁初始浓度的升高，上清液对AFB₁的降解效率不断降低，当浓度增至1000 ng/mL时，24 h降解率降至16.47%;随着反应时间的延长，AFB₁降解率均逐渐增大。菌株GDAAS003上清液对100 ng/mL AFB₁在96 h的降解率为75.68%，对50 ng/mL AFB₁在96 h的降解率可达90.50%;当浓度增至500 ng/mL时，上清液在96 h时的降解率仍可达54.12%，说明菌株GDAAS003对高浓度AFB₁也有较强的降解能力。

2. 5 SOS毒性评估试验结果

SOS毒性评估试验以大肠杆菌PQ37為试验菌，其基因中融合有操纵子sfiA和lacZ基因，当有遗传毒

性化合物存在时，可诱导大肠杆菌K12中的SOS修复系统，诱导β-Gal同时表达，因此可通过比较β-Gal活性和代表大肠杆菌K12细胞活性的AP活性，得出该化合物的遗传毒性。各处理组在降解AFB₁后经一系列混合液活化，进行SOS显色试验，结果如图8所示。从3组反应数据对比可明显看出，未降解AFB₁阳性对照组的IF最大，IF=2.21≥1.5，表明具有遗传毒性。大肠杆菌K12降解AFB₁的IF略低于未降解AFB₁阳性对照组，IF=2.13≥1.5，也具有遗传毒性。而菌株GDAAS003的上清液处理组的IF（1.31）明显小于1.5，可见在菌株GDAAS003的上清液中检测不出遗传毒性。

2. 6 菌株GDAAS003对黄曲霉菌的抑制效果

由图9可看出，接种A. flavus CGMCC3.4409的感染组长满了黄绿色的黄曲霉菌，接入GDAAS003上清液可明显抑制A. flavus CGMCC3.4409的生长。通过HPLC检测（图10），发现接入GDAAS003上清液的样品中AFB₁含量为1.03 mg/kg，而接入灭活上清液的样品中AFB₁含量为1.27 mg/kg，接种A. flavus CGMCC3.4409的样品AFB₁含量最高，为2.52 mg/kg;同时不论是灭活前还是灭活后的GDAAS003上清液均不能在玉米粉培养物中产生AFB₁。由此可知，GDAAS003上清液既能抑制黄曲霉菌的生长，又可减少黄曲霉菌感染样品中的AFB₁含量。

3 讨论

如何利用微生物降解霉菌毒素一直是农业领域中比较关注的科学问题。尽管已知能降解霉菌毒素的微生物种类很多，但能应用的菌株却很少，因此必须扩大菌种筛选范围来获得更多地高效降解霉菌毒素的微生物菌株。放线菌是一类非常重要的农业微生物，因其可生产大量活性物质，如抗生素、抗真菌、抗病毒和抗癌药物;同时链霉菌还常被用于工业酶生产（水解酶、转移酶和酯酶）等。链霉菌对产生霉菌毒素的真菌的拮抗作用已得到了一些试验证实。Sakuda等（1996）发现Streptomyces（MRI142）菌株产生一种活性物质Aflastatin A，能有效阻止寄生曲霉产生黄曲霉素的生物合成。Yekkour等（2012）从撒哈拉土壤中分离获得一些链霉菌菌株，发现其可缓解由镰刀菌（Fusarium culmosum）引起的大麦幼苗病症。本研究通过富集培养，从土壤中分离得到了1株AFB₁高效降解菌株，通过形态学观察和16S rRNA鉴定为S. cerasinus GDAAS003。该菌株也能有效控制产黄曲霉毒素真菌A. flavus CGMCC3.4409的生长，不论是灭活前还是灭活后的GDAAS003上清液均能减少AFB₁合成量，说明GDAAS003上清液中含有一些阻止AFB₁合成的代谢物质。

El-Sharkawy和Abul-Hajj（1987）研究发现一些链霉菌不仅能阻止黄曲霉毒素的生长，还能降解AFB₁。在本研究中，S. cerasinus GDAAS003同样具有类似的功能。通过对其降解AFB₁活性物质存在部位分析，发现降解AFB₁的活性物质主要存在于上清液中，且降解AFB1的活性物质对蛋白酶K和温度均十分敏感，推测S. cerasinus GDAAS003上清液中降解AFB₁的物质很有可能是胞外酶。经测定S. cerasinus GDAAS003上清液在最适pH和最适温度下对100 ng/mL AFB₁96 h的降解率为75.68%;对50 ng/mL AFB₁96 h的降解率为90.50%;甚至对1000 ng/mL AFB₁96 h的降解率也超36.00%。这个降解率与一些具有脱毒功能的链霉菌相比较有一定优势，例如S. spiroverticillatus K128和S. violaceoruber K136等菌株对1 μg/mL AFB₁5 d的降解率仅分别为1.26%和4.79%（Harkai et al.，2016）。文献报道的其他AFB₁降解菌株的降解率，如Streptomyces sp T1-4-1（24 h，65%）（陈晓飞等，2011）、 Myxococcus fulvus ANSM068（48 h，71.89%）（Zhao et al.，2011）、B. shackletonii L7（72 h，77.9%）（Liang et al.，2017）、P. stutzeri HAI2（72 h，72.5%）（宋茂鹏等，2021）等，只与本研究菌株S. cerasinus GDAAS003降解100 ng/mL AFB₁的能力相当。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

降解产物的遗传毒性是评估其生物安全性的指标。SOS反应利用大肠杆菌K12的突变体PQ37作为检测致突变物質的菌株（Krifaton et al.，2011）。一般认为，AFB₁通过细胞色素P450（CYP）介导的反应产生活性代谢物AFB₁8，9-环氧化物，从而产生遗传毒性效应。本研究中，S. cerasinus GDAAS003降解AFB₁的产物对大肠杆菌PQ37的遗传毒性明显低于对照。之前已证明，用黄曲霉毒素降解酶处理AFB₁会改变呋喃环的双键，从而改变分子的荧光和致突变性（Lapalikar et al.，2012），尽管还需后续进一步鉴定降解产物的结构，但本研究结果表明GDAAS003降解AFB₁的产物致突变性已明显降低。以上结果表明，S. cerasinus GDAAS003不仅可以合成降解AFB₁的胞外酶，还能分泌抑制黄曲霉菌生长的次生代谢产物，是一类具有开发潜力的防控黄曲霉菌感染的生物防控菌剂，但具体机制有待进一步研究。

4 结论

本研究通过富集培养，从土壤中分离得到1株AFB₁高效降解菌株S. cerasinus GDAAS003，其对大肠杆菌PQ37不具备遗传毒性;不仅能分泌AFB₁降解酶，还能抑制黄曲霉菌生长，在黄曲霉毒素防控方面具有一定的开发价值和应用潜力。

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（責任编辑 罗 丽）B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014