阿魏菇粗多糖体外脾细胞调节功能及体内疫苗佐剂功能的研究

史 茜，胡都斯·艾尔肯，龙志新，王科珂，蒋刚强，史向向，张富春

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046；2.乌鲁木齐海关技术中心，新疆乌鲁木齐 830063；3.吐尔尕特海关，新疆吐尔尕特 845452

随着中医药学研究的进展，对药食用途的真菌中活性成分如多糖[1]、生物碱[2]、萜类化合物[3]等研究正深入开展。国内外学者通过体内、体外试验揭示了药食用途真菌中的生物活性物质具有抗菌[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]和调节免疫[8]等生物学功能。

阿魏侧耳(Pleurotusferulae)也称阿魏菇，是生长在药用植物阿魏上的一种药食同源的大型真菌。研究表明，阿魏菇富含蛋白质、氨基酸、多糖、生物碱等多种营养物质，具有调节机体免疫、抗衰老、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤、降血脂等功效[9]。阿魏菇多糖(Pleurotusferulaepolysaccharide，PFP)的研究显示，其在增强免疫和抑制肿瘤方面具有良好的效果[10-11]，应用前景广阔。

多糖属于一类天然聚合物，由糖化连接的碳水化合物单体组成[12]。多糖作用很多，如具有激活巨噬细胞、B淋巴细胞、NK细胞和T淋巴细胞的能力，也可促进细胞分泌细胞因子、抗体和补体等免疫相关分子[13-14]。多种天然多糖能增强机体的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫功能，可以作为疫苗的候选佐剂，如川明参多糖、肉苁蓉多糖等都可以作为口蹄疫疫苗的佐剂，发挥很好的效果[15-16]。

本研究将阿魏菇粗多糖(Pleurotusferulaecrude polysaccharide，PFCP)体外作用于小鼠脾细胞，检测其对小鼠脾细胞增殖能力和细胞因子分泌的影响。同时将PFCP与口蹄疫灭活抗原(Foot-and-mouth disease virus inactivated antigen,iFMDV)共同免疫小鼠，检测其对免疫后小鼠体液免疫和细胞免疫的影响，为PFCP作为新型疫苗佐剂的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级ICR小鼠，雌性，6周龄～8周龄，购自新疆医科大学动物实验中心，证书编号：SCXK(新)2018-0002。研究中涉及的所有操作均符合动物福利指导规则。

1.1.2 材料及试剂 PFCP由新疆生物资源与基因工程重点实验室李金玉提纯。体外试验所用PFCP用RPMI1640培养基溶解为20 mg/mL的溶液，体内试验所用PFCP用9 mg/mL的NaCl溶解为16 mg/mL的溶液，除菌分装，冷冻保存。O型口蹄疫病毒灭活抗原(O/MYA98/BY/2010株)，中农威特生物科技有限公司惠赠。蒙大拿ISA 206 VG佐剂，SEPPIC特殊化学品有限公司(中国上海)惠赠。IgG羊抗鼠HRP-酶标二抗，Southern Biotechnology公司产品；APC Anti-Mouse CD3e Antibody、FITC Anti-Mouse CD4 Antibody、PE Anti-Mouse CD8a Antibody流式细胞检测用单克隆抗体，IFN-γ和IL-4细胞因子ELISA检测试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司产品；胎牛血清、RPMI1640培养基、PBS，Gbico公司产品；噻唑蓝(MTT)、刀豆蛋白 A(ConA)、脂多糖(LPS)与二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司产品。红细胞裂解液，北京鼎国生物科技有限公司产品；其他化学试剂均为分析醇，天津市北联精细化学品开发有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 高速冷冻离心机，日本Hitachi公司产品；超净工作台，美国Thermo公司产品；倒置显微镜，日本Olympus公司产品；CO2培养箱，美国Nuaire公司产品；SpectraMax Plus 384酶标仪，美国Molecular Devices公司产品；流式细胞仪，美国BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 阿魏菇粗多糖中多糖含量测定 以干燥至恒重的D-葡萄糖为标准品，用苯酚-硫酸法绘制葡萄糖标准品的标准曲线，以葡萄糖浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，得到回归曲线方程y=0.026 1x-0.003 3，R2=0.999(n=3)。精确称取干燥后恒重的PFCP 10 mg，以蒸馏水稀释至100 μg/mL和50 μg/mL。吸取PFCP溶液1 mL至反应管，每个浓度设置重复对照，向每个反应管中加入0.5 mL 60 mg/mL苯酚溶液，振荡混匀，向每管加入2.5 mL浓硫酸并混匀，静置20 min，取100 μL加入到96孔板中，测定OD 490 nm值。代入回归曲线方程计算多糖含量。

1.2.2 小鼠脾细胞制备 处死ICR小鼠，无菌获取脾脏，置于铜网上研磨至RPMI-1640完全培养基中，收集悬液，1 500 r/min，离心5 min，弃上清。加入红细胞裂解液1 mL，裂解3 min，1 500 r/min，离心5 min，弃上清，收集细胞。重悬细胞，台盼蓝染色计数，活细胞数>95%时，用于后续试验。

1.2.3 阿魏菇粗多糖对脾细胞毒性检测 取1.2.2制备的脾细胞悬液，调整浓度至5×106个/mL。将细胞悬液100 μL/孔加入96孔板，试验组加入100 μL/孔PFCP溶液(终浓度为50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL)，以RPMI-1640完全培养基为细胞对照孔，加入LPS(10 μg/mL)和ConA(5 μg/mL)组为阳性对照，各组设5个重复。于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中分别培养20、44、68、92 h后，加入MTT 10 μL/孔，继续培养4 h，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入100 μL/孔DMSO，室温振荡混合，酶标仪检测OD 570 nm值。以加入多糖孔OD值不显著低于细胞对照孔OD值的最高浓度作为最大细胞安全浓度。

1.2.4 阿魏菇粗多糖协同刺激脾脏淋巴细胞增殖试验 取1.2.2制备的脾细胞悬液，调整细胞数量至2.5×106个/mL。将细胞悬液100 μL/孔加入 96 孔板，试验组每孔加入10 μL ConA(10 μg/mL)或 LPS(5 μg/mL)及90 μL/孔PFCP溶液(终浓度为50、100、200、400、800 μg/mL)，以RPMI-1640完全培养基为细胞对照，于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中分别培养44 h后，加入MTT 10 μL/孔，继续培养4 h，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入100 μL/孔DMSO，室温振荡混合，酶标仪检测OD 570 nm值。各组设5个重复。并按公式计算淋巴细胞增殖率[8]:增殖率=(药物组OD 570 nm-细胞或LPS对照组OD 570 nm)/细胞或LPS对照组OD 570 nm× 100%(OD为平均值)

1.2.5 细胞因子含量检测 按1.2.2制备脾细胞，将脾细胞调整至1×106个/mL，1 mL/孔细胞悬液加入24孔板，每组设置3个复孔，加入1 mL/孔含PFCP溶液(终浓度为50、100、200、400、800 μg/mL)，以RPMI-1640完全培养基为细胞对照，于37 ℃、体积分数为5%的CO2的条件培养48 h，10 000 r/min离心5 min，收集上清，按照ELISA试剂盒说明书检测样品中IFN-γ和IL-4含量。

1.2.6 免疫分组及免疫策略 试验分为6组，每组6只小鼠，每只按100 μL剂量，以皮下注射方式免疫接种小鼠，免疫2次，两次免疫间隔14 d。具体分组如下：9 mg/mL的NaCl对照组、iFMDV组(灭活抗原15 μL/只+9 mg/mL的NaCl 85 μL/只)、100 μg/mL PFCP+iFMDV组(灭活抗原15 μL/只+9 mg/mL的NaCl 75.5 μL/只+PFCP 9.5 μL/只)、200 μg/mL PFCP+iFMDV组(灭活抗原15μL/只+9 mg/mL的NaCl 66μL/只+PFCP 19 μL/只)、400 μg/mL PFCP+iFMDV组(灭活抗原15 μL/只+9 mg/mL的NaCl 37 μL/只+PFCP 38 μL/只)、ISA 206+iFMDV组(灭活抗原15 μL/只+9 mg/mL的NaCl 35 μL/只+ISA 206 50 μL/只)。

1.2.7 特异性IgG抗体水平检测 在小鼠初次免疫后的14、21、28 d，利用眼眶静脉丛采血方法获取全血并分离血清。将100 μL/孔灭活抗原包被酶标板，4 ℃过夜孵育。彻底清洗后，以50 mg/mL的脱脂奶粉封闭液，37 ℃封闭1 h。加入1∶200稀释的被检血清，37 ℃孵育1 h。加入1∶2 000稀释的羊抗鼠HRP-酶标二抗，37 ℃孵育1 h。加入TMB显色液，室温避光孵育15 min；加入终止液，在酶标仪上读取OD 450 nm/OD 630 nm值。

1.2.8 T淋巴细胞亚群检测 第二次免疫14 d后，处死小鼠，摘取脾脏组织。按1.2.2制备脾脏细胞，取100 μL(约1×106细胞)脾脏细胞悬液，加入10 μL CD3e-APC、CD4-FITC、CD8a PE抗体，旋涡振荡，室温暗孵15 min。终止反应，离心弃上清液，加入500 μL PBS重新悬浮细胞，上机检测。

2 结果

2.1 阿魏菇粗多糖中多糖含量测定

利用苯酚-硫酸法对PFCP的多糖含量进行测定，结果显示,PFCP的多糖含量为63.3%。

2.2 阿魏菇粗多糖对脾细胞毒性检测

最大无毒浓度试验是体外检测药物毒性的重要指标。将PFCP加入脾细胞中使其终浓度为50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL，分别培养24、48、72、96 h，检测其最大无毒浓度。当多糖浓度在50 μg/mL～1 600 μg/mL时，OD值均未显著低于细胞对照，说明在该浓度范围内PFCP对脾细胞毒性不明显(P>0.05)，最大无毒浓度为1 600 μg/mL(表1)。

表1 PFCP对脾细胞毒性检测结果

2.3 阿魏菇粗多糖体外对脾脏淋巴细胞增殖的影响

PFCP与ConA或LPS协同刺激脾脏淋巴细胞增殖试验结果显示，与ConA组比较，PFCP浓度在50 μg/mL～800 μg/mL时，均可协同ConA显著促进脾脏淋巴细胞的增殖(P<0.01)；与LPS组比较，PFCP在50 μg/mL可协同LPS显著促进脾脏淋巴细胞的增殖(P<0.05)。结果说明，PFCP可协同ConA和LPS促进脾脏淋巴细胞的增殖(图1)。

A.ConA;B.LPS

2.4 阿魏菇粗多糖体外对脾细胞分泌细胞因子能力的影响

不同浓度的PFCP与脾脏细胞共培养48 h，ELISA检测培养上清中IL-4和IFN-γ细胞因子表达。结果显示，PFCP浓度在50 μg/mL～400 μg/mL时，IFN-γ表达量显著或极显著地高于对照组(P<0.05，P<0.01)。当PFCP浓度在50 μg/mL～200 μg/mL时，IL-4表达量极显著地高于对照组(P<0.01)(图2)。结果表明，PFCP体外可显著促进小鼠脾细胞分泌IFN-γ与IL-4。

图2 PFCP刺激脾细胞对产生IFN-γ(A)和IL-4(B)细胞因子的影响

2.5 阿魏菇粗多糖对特异性抗体产生的影响

低(100 μg/mL)、中(200 μg/mL)、高剂量(400 μg/mL)PFCP分别与iFMDV混合后皮下注射免疫接种小鼠，在第1次免疫后14、21、28 d，分别采集小鼠血样，分离血清，间接ELISA测定iFMDV特异性抗体水平，用以评估PFCP的佐剂特性。结果显示，与抗原对照组(iFMDV)比较，PFCP中剂量组的抗体水平在免疫后21 d和28 d，差异显著(P<0.05)，高剂量组在免疫后21 d(P<0.05)和28 d(P<0.01)均具有显著性差异，ISA 206佐剂组和PFCP高剂量组之间差异不显著(图3)。表明PFCP能有效增强iFMDV刺激的特异性抗体的产生。

图3 PFCP对iFMDV特异性抗体产生的影响

2.6 阿魏菇粗多糖对T淋巴细胞亚群的影响

为了检测PFCP对T淋巴细胞亚群的影响，在第2次免疫接种后14 d，无菌摘取小鼠脾脏，通过流式细胞检测CD3+CD4+T和CD3+CD8+T淋巴细胞亚群比例。结果可知，PFCP低、中剂量组与iFMDV组比较差异不显著(P>0.05)，ISA 206佐剂组、PFCP高剂量组与iFMDV组比较均能够显著增加CD3+CD4+T淋巴细胞的数量(P<0.05)(图4)，极显著增加CD3+CD8+T淋巴细胞的数量(P<0.01)，且ISA 206佐剂组与PFCP高剂量组之间无显著差异(P>0.05)(图5)。结果说明，PFCP高剂量组可以显著提升CD3+CD4+T和CD3+CD8+T淋巴细胞亚群的细胞数量。

图4 PFCP对脾脏CD3+CD4+ T淋巴细胞亚群的影响

图5 PFCP对脾脏CD3+CD8+ T淋巴细胞亚群的影响

3 讨论

研究表明，多糖具有复杂多样的生物学活性，如抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等[17]。许多药食同源的真菌多糖都具有促进淋巴细胞增殖的活性，这是其发挥免疫增强作用的主要机制。如猴头菇多糖能有效促进免疫健全小鼠T、B淋巴细胞的增殖，显著促进淋巴细胞分泌IL-2、IL-4以及INF-γ，显著提高免疫缺陷小鼠的外周血白细胞及骨髓有核细胞数量，促进ConA和LPS诱导的T、B脾淋巴细胞增殖，提高脾脏NK细胞的杀伤活性，并能提高血清中IL-2的分泌水平[18]。姬松茸多糖能够显著提高小鼠脾脏和胸腺指数，极显著促进D-半乳糖诱导的衰老小鼠脾细胞增殖，增加衰老小鼠血清中TNF-α、IL-6含量[19]。阿魏菇粗多糖可以明显促进ConA刺激的小鼠脾T淋巴细胞的增殖反应，阿魏侧耳胞外多糖可显著提高巨噬细胞对IL-1和IL-6的分泌量及脾淋巴细胞对IL-2和INF-γ的分泌量[20-21]。

脾脏是机体重要的外周免疫器官，由大量的淋巴细胞组成的，是产生免疫应答和发挥免疫调节作用的重要器官。多糖对脾脏细胞的刺激效应主要通过诱导淋巴细胞的增殖以及刺激细胞因子的分泌等方式进行[22-23]。淋巴细胞增殖水平是反映机体免疫最直接的指标，PFCP体外直接对脾细胞具有浓度依赖性的增殖作用，证明其是一种有丝分裂原，可刺激淋巴细胞转化[24]。脾脏淋巴细胞中含有T淋巴细胞和B淋巴细胞，T淋巴细胞具有介导细胞免疫和调节性免疫的功能。B淋巴细胞主要参与体液免疫，释放特异性抗体[25]。ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS则主要诱导B淋巴细胞增殖。PFCP体外可同时促进ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞增殖，表明其对T、B淋巴细胞均有促进作用。说明PFCP通过促进淋巴细胞增殖，达到增强机体免疫能力的目的。

多糖刺激脾细胞分泌细胞因子的水平也能反映其免疫调节活性。PFCP在50 μg/mL～400 μg/mL时可显著诱导Th1型细胞因子IFN-γ的分泌，IFN-γ 能够增强NK细胞和巨噬细胞溶酶体的活性，从而起到免疫调节作用[26]。PFCP在50 μg/mL～200 μg/mL时可显著诱导Th2型细胞因子IL-4的分泌，IL-4 能够刺激B细胞的增殖和分化，促进免疫球蛋白的合成和分泌[27]。Th1细胞主要促进细胞介导的免疫，而Th2细胞以促进抗体产生为主，良好的免疫佐剂应可同时诱导Th1和Th2型免疫应答[28]，PFCP能活化T淋巴细胞，并同时增强Th1和Th2型免疫反应，说明其具有作为免疫佐剂的潜能。

报道显示，阿魏菇多糖能提高脾脏NK细胞的免疫活性，提高脾脏指数及T、B淋巴细胞的转化率，对改善机体免疫功能起重要作用[29]，可以作为宫颈癌疫苗和犬卵透明带3 DNA不孕疫苗的佐剂[30-31]，但未见有将其作为灭活病毒疫苗佐剂的研究的报道。鉴于PFCP在体外试验中具有良好的佐剂潜能，将其与iFMDV疫苗混合后免疫接种小鼠，进一步研究其佐剂功能。IgG含量高低可以反映机体的防御能力[32]。由体内试验结果可知，与iFMDV组比较，PFCP中、高剂量组均可显著促进小鼠特异性IgG抗体的产生，且与商品化口蹄疫灭活疫苗的佐剂ISA 206比较，产生的抗体水平无显著性差异，说明其作为灭活病毒疫苗佐剂，能够提高体液免疫反应，具有免疫增强作用。

疫苗佐剂除了具有诱导特异性抗体生成的能力，还要能够有效地诱导T细胞介导的免疫应答，它在清除病毒和持续抗感染方面发挥重要作用。CD3+存在于所有成熟T淋巴细胞的表面，是鉴定和区别T淋巴细胞的主要标志[33]。CD4+和CD8+是T淋巴细胞的重要亚群，CD4+是辅助性T淋巴细胞，能够刺激细胞因子的分泌，具有诱导和增强免疫应答的作用用来调节免疫反应，而CD8+是细胞毒性T淋巴细胞，能够介导免疫反应，防御进入细胞内的病原体，这是两种对适应性免疫至关重要的常见T淋巴细胞[34]。试验结果表明，PFCP作为iFMDV疫苗佐剂能够提升CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞的数量，这也证实了PFCP具有较强的促进细胞免疫的能力。

综上所述，PFCP体外能够单独或者协同ConA和LPS促进脾细胞的增殖，并且促进小鼠脾细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4。PFCP体内作为iFMDV疫苗佐剂促进小鼠IgG抗体的产生，并促进CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞的增殖，其抗体水平及CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分率含量与ISA 206佐剂相比较无显著差异，具有较好的淋巴细胞增殖能力和疫苗佐剂作用，值得深入研究。