出口盐渍肠衣中细菌总数和需氧芽孢总数的测定

宋鸿雁，张 娜，仇保丰，高雪梅，刘 春，刘文斌，朱顺星

(1.南通大学实验动物中心，江苏南通 226001；2.湛江海关技术中心，广东湛江 524000；3.南通海关，江苏南通 226004)

天然肠衣(natural casings)是采用健康牲畜的食道、胃、小肠、大肠和膀胱等器官，经过特殊加工，对保留的组织进行盐渍或干制的动物组织，是灌制肉制品的衣膜[1]。天然肠衣加工是我国传统优势产业，我国也是世界最大的肠衣出口国，全世界近60%的天然肠衣在中国加工[2]。据统计，仅2018年我国就出口肠衣10.28万吨，创汇13.65亿美元，产品远销德国、荷兰、美国和日本等40多个国家和地区。目前，我国出口肠衣主要为成品盐渍肠衣。已有研究表明，按照标准工艺来腌制和储存盐渍肠衣，能有效杀灭和控制肠衣携带的细菌，除细菌芽孢外，能使不产芽孢细菌的污染水低于当前的各种限量标准[3-4]。但是，据统计，2006年—2016年欧盟召回我国输欧肠衣共计59批，其中10%以上是因为检出沙门氏菌所导致[5]。另外，有国外学者研究发现，中国出口盐渍肠衣携带还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的芽孢数量(sulphite-reducingClostridium-spores)存在超过限量标准的现象[4]。尤其值得关注的是，欧洲天然肠衣协会(European natural sausage casings association，ENSCA)近年来频繁对出口欧盟的盐渍肠衣微生物推荐值进行更新，且新增了针对蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus，B.cereus)的限量指标[6]。由于盐渍肠衣携带的细菌中60%以上为芽孢杆菌(Bacillus)[7]，且芽孢杆菌的种类繁多，能引起人和动物发病的致病菌与可用作饲料添加剂的益生菌同时存在，所以应该区别对待。由此可见，我国出口盐渍肠衣携带细菌总体水平和需氧芽孢菌的情况均需要引起关注，但截至目前国内均未见相关研究报道。本研究对南通地区出口盐渍肠衣的菌落总数、需氧芽孢数量及需氧芽孢菌的菌群组成等进行测定，为掌握我国出口盐渍肠衣携带细菌情况提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源及处理 5份盐渍猪肠衣和5份盐渍羊肠衣均为2020年—2021年南通肠衣生产加工企业出口送检样品，剪碎、混匀后置-20 ℃冻存备用。

1.1.2 主要试剂 平板计数琼脂(Plate Count Agar，PCA)，北京陆桥技术有限责任公司产品；葡萄糖胰蛋白胨琼脂(dextrose tryptone agar，DTA)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品；酵母浸提物和胰蛋白胨，Oxoid公司产品；琼脂粉，中国医药(集团)上海化学试剂公司产品；细菌基因组提取试剂盒(TIANamp bacteria DNA Kit)，天根生化科技(北京)有限公司产品；pGEM-T easy vector，Promega公司产品；dNTPs(10 mmol/L)、rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、DNA Marker DL 2 000、DNA胶回收试剂盒、16S rDNA Bacterial identification PCR Kit，TaKaRa公司产品。

1.1.3 主要仪器 生物安全柜(BSC-1360 ⅡA2)，北京东联哈尔滨仪器制造有限公司产品；PCR仪(MyCycler)、琼脂糖凝胶电泳仪(PowerPac Basic)，Bio-Rad公司产品；凝胶成像系统(Tanon-4600SF)，上海天能科技有限公司产品；恒温培养摇床(THZ-100B)，上海一恒科技仪器有限公司产品；全自动高压灭菌器(ES-315)，日本Tomy公司产品；台式高速冷冻离心机(MIKRO 22R)，德国Hettich公司产品，电热恒温培养箱(XP-9272-1A)，上海析谱仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌落总数的测定 盐渍肠衣样品菌落总数的测定按文献[8]进行。

1.2.2 需氧芽孢数量的测定 盐渍肠衣中需氧芽孢的测定方法参照文献[9-10]并略作改动，操作方法简述如下:将样品解冻后各称取25 g并分别加入225 mL无菌PBS溶液(pH 7.2)，振荡混匀后于沸水中放置15 min，流水冷却后吸取初始悬液1 mL加入无菌平皿内，每个样品做5个平行，同时设立空白对照，各平板内加入适量55 ℃水浴保存的DTA，混匀后静置，凝固后倒置培养箱内55 ℃±1 ℃培养48 h～72 h，5个平板上的菌落数相加后再乘以2，即为1 g盐渍肠衣中的需氧芽孢数量。

1.2.3 需氧芽孢菌的分离鉴定 将1.2.2部分10份盐渍肠衣的DTA平板分别拿出，各样品5块DTA平板上疑似需氧芽孢菌的菌落总数≤5个的，全部挑取；疑似需氧芽孢菌的菌落总数>5个的，随机挑取5个，合计挑取细菌41株。将41株细菌分别用三区划线法接种LB琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养24 h～72 h后，再从各平板挑取单菌落重复上述操作将细菌纯化3代。挑取单菌落接种LB液体培养基内，36 ℃±1 ℃振荡培养过夜，收集菌液用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取细菌总DNA，以此为模板用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit扩增细菌16S rDNA，切胶回收目的条带并克隆入pGEM-T easy vector，转化DH5α后涂布AIX平板过夜培养，挑取白色菌落用PCR鉴定出阳性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA序列测定，最后将所得测序结果输入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/进行网上比对，寻找16S rDNA同源性最高的且高于97%的已知细菌，即可确定该需氧芽孢菌的种类。

2 结果

2.1 菌落总数的测定结果

按照文献[8]的方法分别对10份出口盐渍肠衣进行了菌落总数测定(图1)，发现5份盐渍羊肠衣的菌落总数介于50 CFU/g～8.0×102CFU/g之间，5份盐渍猪肠衣的菌落总数介于1.4×102CFU/g～2.4×103CFU/g之间(表1)。总体而言，出口盐渍猪肠衣携带细菌的水平要高于出口盐渍羊肠衣，但是两种出口盐渍肠衣的菌落总数均远低于ENSCA推荐的完全可接受的菌落总数(<1.0×105CFU/g)。

图1 盐渍猪肠衣的菌落总数测定

2.2 需氧芽孢数量的测定结果

分别对10份出口盐渍肠衣进行了需氧芽孢数量的测定，经过55 ℃ ±1 ℃培养48 h～72 h发现，疑似需氧芽孢菌在DTA平板上为黄色菌落，菌落周围培养基也由紫色变为黄色(图2)。统计显示，5份盐渍羊肠衣和的需氧芽孢数量介于0 CFU/g～26 CFU/g之间，5份盐渍猪肠衣的需氧芽孢数量介于4 CFU/g～1.2×102CFU/g之间(表1)。总体而言，出口盐渍猪肠衣携带需氧芽孢的总体水平也要高于出口盐渍羊肠衣。

图2 葡萄糖胰蛋白胨琼脂(DTA)平板上的需氧芽孢菌菌落

表1 盐渍肠衣菌落总数和需氧芽孢数量的测定结果

2.3 需氧芽孢菌的分离鉴定

从DTA平板上随机挑取的41株细菌经纯化、16S rDNA测序和分析，显示为来自芽孢杆菌属(Bacillus)的11种细菌，其中热带芽孢杆菌(B.tropicus)所占比重最高，约25%(10/41)，另外，高地芽孢杆菌(B.altitudinis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)等所占比例也较高，为优势菌株(表2和图3)。值得关注的是，从2份不同的样品中各鉴定出1株B.cereus，这是肠衣污染细菌中被ENSCA认定为具有生物危害的细菌之一。

A.高地芽孢杆菌；B.苏云金芽孢杆菌；C.巨大芽孢杆菌；D.热带芽孢杆菌；E.蜡样芽孢杆菌；F.副炭疽芽孢杆菌

表2 盐渍肠衣中需氧芽孢菌的鉴定结果

3 讨论

肠衣是由动物肠管等加工而成，在肠管去粪、清洗、贮存、运输和加工等过程中，难免会受到肠内和外界环境的微生物污染。肠衣污染和携带微生物，一方面能够引起肠衣腐败变质，严重影响肠衣的感官评价和产品质量，甚至丧失使用价值，给肠衣加工企业带来巨大经济损失[11]；另一方面，在肠衣携带的微生物中，部分具有潜在生物危害的微生物，如小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒、沙门氏菌、单增李斯特菌、还原亚硫酸盐梭菌和蜡样芽孢杆菌等，可对畜牧业生产或食品安全等造成威胁[4,6,12-15]。因此，国外已对辐射、臭氧、抑菌剂和栅栏技术等杀灭肠衣微生物开展了大量研究[6-7,16-17]。

利用NaCl腌制(盐渍)技术来杀灭和控制肠衣微生物，是肠衣加工和保存中拥有几百年历史的传统工艺[18]。目前国际贸易中的半成品和成品肠衣绝大多数是经过腌制处理的肠衣。但是，即便是经过腌制处理的肠衣也无法完全彻底杀灭所有细菌，且无法杀灭肠衣中的细菌芽孢[3-4,7,19]。为了降低肠衣的微生物安全风险，ENSCA在2019年6月公布的最新版《ENSCA cGGP revision Ⅷ》中，将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等7种细菌列为肠衣生产中潜在的生物危害，同时对盐渍肠衣的菌落总数、肠杆菌数等提出了严格的限量指标[6]。由于欧盟是全球肠衣进口的主要市场，仅德国、法国和意大利3个国家的进口肠衣量就占全球肠衣贸易量的62%，我国有近50%的出口肠衣销往欧盟市场[20-21]。另外，《ENSCA cGGP》早在2013年就被国际天然肠衣协会认可，并被纳入其制定的《天然肠衣加工HACCP 手册》之中。我国作为世界最大的肠衣出口国家且欧盟国家一直是我国的传统出口市场，但是2007年-2017年我国受通报的出口肠衣达35批，其中34批(占比97%)是由欧盟技术壁垒引起[22]。因此，必须立即开展相关的技术研究和资料储备，才能为主动回应食品安全问题和破除国外技术性贸易壁垒等打下基础。本研究首先对南通地区出口盐渍肠衣的菌落总数进行测定，可为掌握我国出口盐渍肠衣携带细菌的总体水平提供参考。

NaCl对肠衣细菌的杀灭效果还会受到盐渍时间、温度、盐浓度(水活度aw)、pH等因素影响[23-24]。另外，对盐类有抵抗作用的细菌，特别是耐盐菌或嗜盐菌等也可能起肠衣变质[4]。因此，不同腌制工艺加工的盐渍肠衣，其菌落总数往往会相差甚远。Byun M W等[25]对贸易商新鲜盐渍的半干肠衣进行研究，发现盐渍猪肠衣的细菌总数、肠球菌和大肠菌群分别为 6.78、5.61、5.54 log10CFU/g；盐渍羊肠衣的细菌总数、肠球菌和大肠菌群分别6.61、3.04、3.93 log10CFU/g。Madhwaraj S等[26]对羊肠衣的菌落总数和嗜盐菌分别进行了研究，发现两者的数值分别为1.2×103CFU/g和0.9×103CFU/g。ENSCA近年来对盐渍肠衣加工的标准工艺进行了修订:将经过刮制、清洗等加工处理后的动物原肠，用NaCl干盐(Aw为0.75)或饱和盐水(Aw为0.75～0.80)密封腌制至少30 d，30 d的腌制期和随后的储存期等无需特定的温度，以便最大程度降低细菌污染的风险[6]。ENSCA目前对盐渍肠衣菌落总数的推荐值为<1.0×105CFU/g为完全可接受；5.0×106CFU/g为最大值[6]。中国肉类协会天然肠衣分会在国内肠衣加工出口企业中宣贯和推行《ENSCA cGGP》已有近10年时间，但当前我国出口盐渍肠衣污染和携带细菌的实际水平如何，一直未见系统全面的研究和报道。本研究对2020年-2021年南通地区拟出口的5份盐渍羊肠衣和5份盐渍猪肠衣样品，分别进行了菌落总数测定，结果发现，2种盐渍肠衣的菌落总数均远低于ENSCA的推荐值，说明上述盐渍肠衣污染和携带细菌的总体水平较低。另外，连续多年来我国出口盐渍肠衣罕有因为菌落总数超标而引起国外客户退运事件的发生，也一定程度上反映了本研究结果具有较高的可信度。

根据盐渍肠衣的原料来源和加工特性，各种细菌芽孢都可能污染肠衣，对其中致病菌芽孢与益生菌芽孢应该区别看待，因此掌握我国出口盐渍肠衣携带需氧芽孢菌的总体水平及其菌群结构和组成很有必要。本研究对10份盐渍肠衣的需氧芽孢菌的芽孢数量进行了测定，结果发现5份盐渍羊肠衣的需氧芽孢数介于0 CFU/g～26 CFU/g之间，5份盐渍猪肠衣的需氧芽孢数介于4 CFU/g～1.2×102CFU/g之间(表1)，总体而言，盐渍肠衣携带需氧芽孢数量相对偏低。课题组经过分析，认为造成这种现象的原因有两种可能:一种可能是近年来肠衣肝素钠价格猛涨，加工中过度刮制和冲洗肠管等操作，导致了本研究所用盐渍肠衣中需氧芽孢的数量确实偏低，此推测与样品菌落总数的测定结果比较一致。另一种可能是检测方法本身存在的不足导致了上述结果，目前国内外尚未见盐渍肠衣需氧芽孢计数的标准和规范，与此相关的研究报道也极少。因此，本研究对国内仅有的3项分别用于乳与乳制品[27]、出口食品[9]和化妆品[10]中需氧芽孢计数的行业标准进行分析，发现3者主要操作程序基本一致，且所使用的计数培养基均为DTA，因此综合参考上述标准并略作改动，对10份盐渍肠衣样品分别进行了需氧芽孢计数(表1)。但究竟是何种原因造成需氧芽孢计数结果偏低，目前尚无法判断，这可能需要更多的摸索和研究才能得出结论。

产芽孢的细菌是一群差异很大的细菌，包括芽孢杆菌属(Bacillus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)和颤螺菌属(Oscillospira)6个属，其中芽孢八叠球菌为严格需氧菌，梭菌、脱硫肠状菌和颤螺菌为严格厌氧菌，而芽孢杆菌和芽孢乳杆菌为需氧、微需氧或兼性厌氧菌[28]。为了研究盐渍肠衣携带需氧芽孢菌的菌群结构和组成，课题组从DTA平板上挑出41株细菌进行了纯化和鉴定，结果发现它们是来自Bacillus的11种细菌，其中热带芽孢杆菌(B.tropicus)、高地芽孢杆菌(B.altitudinis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)等所占比重也较高，为优势菌株(见表2)。另外，从2份不同的样品中各鉴定出1株蜡样芽孢杆菌，这需要引起关注。综上可见，出口盐渍肠衣携带需氧芽孢菌的种类较多，其中包括了可引起人和动物发病的蜡样芽孢杆菌，估计随着分离鉴定菌株数量的增多，将会有更多种细菌被检出。