菌黄保肠合剂对脓毒症大鼠肠道菌群及血清炎症因子的影响研究∗

李建洪 陈 斌 铁明慧 李巽华 龚瑞莹 谢招虎 庞永诚△

（1.云南省昆明市中医医院，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学，云南 昆明 650500）

脓毒症为感染所致的宿主反应失调综合征，主要表现为发热、寒战及精神状态改变等，为重症患者死亡的重要原因［1］。全球每年患病人数接近2 000万，病死率超过25%［2］。肠道是脓毒症影响最早的器官，肠道菌群失调可引发病理性细菌移位，进而诱发机体产生大量炎症因子，进一步加重炎症反应［3］。目前西医调节肠道菌群的主要方法为补充肠道益生菌、肠内营养、益生菌与抗生素联合运用等，临床疗效有待提高［4］。而中医药不仅从临床还是动物实验研究，都已证实某些单味中药或复方制剂均有调节肠道菌群及降低炎症因子水平的作用。菌黄保肠合剂为昆明市中医医院特色院内制剂，具有健脾益气、清热利湿之功效，临床运用多年，效果明显。本研究通过观察菌黄保肠合剂对脓毒症大鼠肠道菌群的改善及血清炎症因子的作用，进一步探讨中医药对于抢救危重症的临床应用价值。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠110只，体质量（220±20）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SXK（湘）2016-0002，饲养于云南中医药大学动物实验中心，许可证号：SYXK（滇）2017-005。研究经云南中医药大学动物实验伦理委员会审查通过，批准文号：R-06201903。

1.2 实验药物 菌黄保肠合剂（黄芪、茯苓、白术、太子参、炒黄连、薏苡仁、神曲、茵陈及石菖蒲），由昆明市中医医院制剂中心制备，具体制备过程：取黄芪300 g，茯苓150 g，白术100 g，太子参200 g，炒黄连100 g，薏苡仁300 g，神曲150 g，茵陈100 g，石菖蒲100 g，置于煎煮容器中煎煮2次，每次加入6倍水量，煎煮50 min，滤液过80目筛，合并两次滤液，滤液浓缩至10 000 mL，加入1‰苯甲酸钠、0.5‰尼泊金乙酯，搅拌均匀即得，规格：100 mL/瓶，批准文号：Z20082615A，成人临床日剂量为22.5 mL。双歧杆菌肠溶胶囊，丽珠医药股份有限公司，规格：0.35 g/粒，国药准字S10960040，成人临床日剂量为1.4 g。

1.3 试剂与仪器 DNeasy PowerSil kit（QIAGEN，12888）、QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit（QIA⁃GEN，51531）、Qubit dsDNA Assay kit（Life Technologies，Q32854）、Tks Gflex DNA Polymerase（Takara，R060B）。台式高速离心机（Eppendorf，Centrifuge 5418）、PCR仪（Bio-rad，580BR10905）、QIAxtractor（QIAGEN，SN002358）、电泳仪（Tanon，HE-120）、凝胶成像仪（Tanon，2500）及超低温冰箱等。

1.4 造模及分组 采用盲肠结扎穿孔法对大鼠进行造模，先将大鼠适应性喂养1周，实验前12 h禁食不禁水，麻醉，剖开腹腔，找出回盲部，在距其末端2 cm处以1号丝线结扎，将肠道内容物推向回盲部远端，用1号针头贯穿穿刺，挤出少许粪便，回纳盲肠，生理盐水复苏，完成脓毒症大鼠的造模。造模成功后将大鼠分成假手术组、模型组、阳性对照组、菌黄保肠合剂低剂量组、菌黄保肠合剂中剂量组及菌黄保肠合剂高剂量组6组。

1.5 干预方法 造模结束后1 d开始给药。菌黄保肠合剂成人用量为90 mL/d，约生药13.5 g/d，按体表计算法得出大鼠低、中、高剂量分别为1.22、6.10、12.20 mg/g，每日2次灌胃。阳性对照组予双歧杆菌粉5 mg/g，每日2次灌胃。假手术组和模型组予生理盐水3 mL，每日2次灌胃。各组共治疗3 d。

1.6 标本采集及检测 用药3 d后各组大鼠在无菌环境下麻醉，开腹，收取结肠组织行细菌培养，经腹主动脉采血6 mL，3 000 r/min离心15 min，收取上层清液，保存于-80℃冰箱备用。1）肠道菌群的测定。收取大鼠结肠组织，行细菌基因组DNA提取，运用16SrDNA通用引物对16SrDNA序列进行扩增，扩增后行SDSPAGE电泳，运用NCBI数据库对细菌进行比较，最后筛选出大肠杆菌、双歧杆菌及乳酸杆菌并进行定量分析。2）血清炎症因子水平测定。采用免疫比浊法检测血清降钙素原（PCT）水平，采用ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，符合正态分布的数据采用F检验，采用率或百分比表示计数资料，采用χ2检验进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠存活率比较 见表1。治疗3 d后，假手术组大鼠全部存活，模型组存活率明显低于假手术组（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组、菌黄保肠合剂低、中、高剂量组大鼠存活率显著升高（P<0.05）；与阳性对照组比较，菌黄保肠合剂低、中、高剂量组大鼠存活率明显升高（P<0.05）；菌黄保肠合剂各剂量组间大鼠存活率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠存活率比较

2.2 各组大鼠肠道菌群定量分析比较 见表2。与假手术组比较，模型组大鼠结肠组织中大肠杆菌含量显著增加，双歧杆菌和乳酸杆菌含量显著减少（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组及菌黄保肠合剂低、中、高剂量组大鼠结肠组织中大肠杆菌含量明显减少，双歧杆菌和乳酸杆菌含量明显增加（P<0.05）；与阳性对照组比较，菌黄保肠合剂低、中、高剂量组大鼠结肠组织中大肠杆菌含量减少（P<0.05），双歧杆菌和乳酸杆菌含量增加（P<0.05）；菌黄保肠合剂各剂量组间大鼠结肠组织大肠杆菌、双歧杆菌及乳酸杆菌含量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组大鼠肠道菌群定量分析比较（Log10N/g，±s）

表2 各组大鼠肠道菌群定量分析比较（Log10N/g，±s）

组别假手术组模型组阳性对照组菌黄保肠合剂低剂量组菌黄保肠合剂中剂量组菌黄保肠合剂高剂量组n 10 8 12 14 14 15大肠杆菌6.17±0.45 14.64±0.63*11.21±0.84△8.14±0.48△#8.33±0.49△#7.73±0.38△#双歧杆菌10.24±0.74 2.74±0.53*6.64±0.54△7.04±0.44△#7.57±0.47△#7.64±0.58△#乳酸杆菌8.55±0.69 1.21±0.48*3.13±0.51△4.79±0.62△#4.11±0.42△#5.13±0.64△#

2.3 各组大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平比较 见表3。与假手术组比较，模型组大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组及菌黄保肠合剂低、中、高剂量组大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平明显降低（P<0.05）；与阳性对照组比较，菌黄保肠合剂低、中、高剂量组大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平降低（P<0.05）；菌黄保肠合剂各剂量组间大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表3 各组大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平比较（±s）

表3 各组大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平比较（±s）

组别假手术组模型组阳性对照组菌黄保肠合剂低剂量组菌黄保肠合剂中剂量组菌黄保肠合剂高剂量组n 10 8 12 14 14 15 PCT（ng/mL）0.77±0.29 4.89±1.17*3.85±0.94△3.12±0.85△#2.86±0.81△#2.16±0.47△#TNF-α（ng/mL）8.22±0.77 34.71±2.12*20.43±1.57△18.13±1.54△#17.73±1.55△#14.43±1.21△#IL-6（pg/mL）14.04±1.42 42.13±5.73*30.98±4.15△28.32±3.73△#26.71±3.14△#21.04±2.26△#

3 讨论

脓毒症发生时，机体处于应急状态，胃肠道黏膜缺血缺氧，肠道生态结构紊乱，进而引起菌群失调，致病菌大量繁殖，肠道大量的细菌及毒素进入血循环，触发细菌易位。易位的细菌成为致病菌，参与炎症反应，加重脓毒症的发生发展。抗生素的使用是治疗脓毒症的基础及必要措施，但随着广谱抗生素的广泛应用，微生物对抗生素的耐药性日益加重，必将诱发患者肠道生态平衡的紊乱甚至是多重耐药菌株感染，这一情况已成为当前脓毒症治疗非常棘手的问题［5］。西医治疗脓毒症肠道菌群紊乱主要采用肠道营养、补充益生菌及护胃抑酸等。而中医药治疗脓毒症肠道菌群的优势在于不仅能从根本上调节机体阴阳平衡，亦能针对脾胃有的放矢［6］。TNF-α在炎症反应中起主导作用，可作为脓毒症的启动因子，能激活细胞因子级联反应，促进其他细胞因子的产生和释放［7］。IL-6与脓毒症发病关系密切，能诱发脓毒症炎症反应，激活凝血，导致循环不稳定等病理生理过程，且与脓毒症病情及预后密切相关［8］。PCT常用于评价脓毒症患者严重程度、治疗及预后，且与疾病的并发症及死亡率相关［9］。

菌黄保肠合剂为昆明市中医医院专家团队研制而成的院内特色制剂，由黄芪、白术、茯苓、太子参、薏苡仁、炒黄连、神曲、茵陈、石菖蒲组成，具有健脾益气、调节脾胃之功效。本方在四君子汤及黄芪四君子汤基础上加减而成，加薏苡仁、黄连、神曲、茵陈、石菖蒲等芳香化湿健脾消积之品，寒温并用，补泻兼施，使脾胃功能进一步得到巩固。脓毒症患者正气不足，加之毒邪乘虚侵袭，气血津液逆乱，升降失常。脾胃为后天之本，易受外邪侵袭，毒邪郁于肠腑或传入阳明，耗伤脾胃之气，内生湿热、痰浊等病理产物。因此，在治疗中，既要解毒通瘀，更要顾护脾胃，补益正气，这是治疗危重患者胃肠功能障碍的根本所在。菌黄保肠合剂通过健脾益气可促进正气恢复，兼以清热利湿，祛除邪实，为标本兼治。

现代药理研究显示，黄芪多糖能降低梗阻性黄疸大鼠组织TNF-α、IL-1β水平，减轻小肠组织病理损害［10］；茯苓多糖能降低胰腺炎大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平，减少小肠黏膜上皮损伤［11］；白术内酯能抑制TNF-α、IL-6产生，白术多糖能修复大肠杆菌腹泻模型小鼠肠道黏膜［12］；太子参可通过P13K/Akt信号通路降低1L-1β和IL-6水平，太子参多糖具有肠道保护作用［13］；黄连具有广谱抑菌活性，可通过下调TNF-α mRNA水平而发挥抗炎作用，且黄连生物碱能对抗结肠炎大鼠的肠道黏膜损害［14］；薏苡仁提取物能抑制多种细菌生长，薏苡仁蛋白具有抗炎活性［15］；神曲能降低功能性消化不良大鼠血清TNF-α含量，增加有益菌群数量，抑制肠杆菌生长［16］；茵陈提取物能通过降低TNF-α、IL-4、IL-6水平而发挥抗炎作用，且具有良好的抑菌能力［17］；石菖蒲水提液具有一定的抗菌杀菌作用，其有效成分细辛醚具有抗炎作用，能抑制TNF-α和IL-1β表达［18］。可见，菌黄保肠合剂中大部分单味药具有降低炎症因子水平、抗菌消炎、保护肠道及调节肠道菌群等作用。

本研究显示，菌黄保肠合剂组大鼠存活率明显高于阳性对照组，说明菌黄保肠合剂能降低脓毒症大鼠死亡率。阳性对照组及菌黄保肠合剂低、中、高剂量组大鼠结肠组织中大肠杆菌含量明显减少，双歧杆菌和乳酸杆菌含量明显增加，说明双歧杆菌肠溶胶囊与菌黄保肠合剂均能调整脓毒症引起的肠道乳酸杆菌、双歧杆菌的降低和大肠杆菌的升高，但菌黄保肠合剂效果更明显。阳性对照组及菌黄保肠合剂低、中、高剂量组大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6表达水平明显降低，且菌黄保肠合剂低、中、高剂量组降低更明显，说明双歧杆菌肠溶胶囊与菌黄保肠合剂均能降低脓毒症大鼠血清炎症因子PCT、TNF-α及IL-6水平，且菌黄保肠合剂效果优于双歧杆菌肠溶胶囊。可见，菌黄保肠合剂可能通过调整脓毒症肠道菌群，防止细菌移位，同时降低脓毒症血清炎症因子水平，发挥双重治疗作用，从而更有效地发挥治疗作用。本研究的创新在于采用菌黄保肠合剂治疗脓毒症肠道菌群紊乱，应用16SrDNA测序对肠道组织菌群进行定量分析，明确了菌黄保肠合剂可以调节脓毒症引起的肠道菌群紊乱，同时考虑到细菌移位后引发的全身炎症反应，故同时检测其炎症因子水平。但中医药治疗脓毒症病因病机复杂，可能从多途径、多靶点发挥作用。所以，菌黄保肠合剂治疗脓毒症的具体机制有待进一步研究。

综上所述，菌黄保肠合剂能调节脓毒症所致的肠道菌群紊乱，降低血清炎症因子水平，降低脓毒症的死亡率，对脓毒症起到治疗作用。