柴胡皂苷B2对LPS诱导的脓毒症肺损伤氧化应激和炎性反应的影响研究∗

余莉萍 余淑菁 李旭成 崔金涛 陆佳鑫

（1.湖北省武汉市中医医院，湖北 武汉 430000；2.湖北省武汉市优抚医院，湖北 武汉 430000）

脓毒症是由于感染导致机体反应异常引发的全身炎性反应综合征，发病过程迅速，于2017年被世界卫生组织列为全球卫生重点防治疾病［1］。脓毒症能引发机体内多种器官的感染，如肺损伤、脑膜炎、胆管炎等，其中肺损伤是常见的并发症，且脓毒症急性肺损伤具有较高发病率、病死率，尽管脓毒症急性肺损伤的相关研究已有所进展，但是病死率仍高达30%左右［2-3］。脂多糖（LPS）是细菌外膜的关键成分，也是诱发多种疾病的致病因素，常用来构建脓毒症急性肺损伤模型［4］。柴胡皂苷B2是从中药柴胡内提取的活性成分，现代药理实验证明具有抗炎、抗氧化、保护肝脏等多种药理活性［5］。有研究结果显示，柴胡皂苷B2能够减轻LPS/氨基半乳糖诱导急性肝损伤小鼠的氧化应激和炎性损伤，改善肝脏的能量代谢［6］，但是对LPS诱导的脓毒症急性肺损伤的研究尚不明确。本研究采用LPS诱导建立脓毒症急性肺损伤模型，观察柴胡皂苷B2对LPS诱导的脓毒症急性肺损伤氧化应激损伤和炎性反应的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验清洁级SD大鼠50只，雌性各半，体质量（200±20）g，8周龄，购买中国食品药品检定研究院，许可证号为：SCXK（京）2012-0068。大鼠饲养于无病原菌的环境内，温度为22～25℃，湿度为50%～65%。

1.2 试剂与仪器 LPS购于美国Sigma公司；柴胡皂苷B2购于成都曼思特生物公司，纯度>99%；TUNEL试剂盒、BCA试剂盒、显色剂购于碧云天生物；B淋巴细胞瘤（Bcl-2）抗体、Bcl-2同源二聚体X蛋白（Bax）抗体、p53抗体、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国Abcam公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒购于南京建成生物研究所；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒、白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒、白细胞介素-6（IL-6）试剂盒购于Diaclone公司。

1.3 造模与分组 将大鼠随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组、模型组和柴胡皂苷B2低、中、高剂量组。除空白对照组外，其余大鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS建立急性肺损伤模型。

1.4 给药方法 造模6 h后，柴胡皂苷B2低剂量组、中剂量组、高剂量组分别腹腔注射柴胡皂苷B2药液5、10、20 mg/kg；空白对照组和模型组注射2 mL的生理盐水。连续给药7 d后，采用戊巴比妥钠麻醉处死大鼠。

1.5 标本采集与检测 1）肺组织湿干比。处死大鼠后，取出右叶肺组织，使用滤纸擦拭干净水分，然后称重。随后置于70℃烘箱内24 h称取质量，用于测定肺组织湿干比。肺组织湿干比=（湿重-干重）/干重×100%。2）TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡。收集大鼠部分左叶肺组织，经过石蜡包埋制成切片后，加入乙醇、二甲苯清洗，室温下加入20 μg/mL蛋白酶K反应15 min，PBS清洗，加入内源过氧化氢酶灭活5 min，利用PBS清洗，加入Tunel试剂，加入DAB显色液孵育10 min，利用乙醇、二甲苯脱水，用中性树胶封片后，在光学显微镜下观察Tunel染色情况，然后计算细胞凋亡率。3）Western blotting检测肺组织Bcl-2、Bax、p53蛋白表达。收集各组部分左叶大鼠肺组织，加入蛋白裂解液进行裂解，然后提取各组的总蛋白，利用BCA试剂盒检测定量蛋白浓度。然后将蛋白煮沸5 min，取35 μg上样蛋白，用8%的分离胶和4%的浓缩胶处理蛋白样品，蛋白样品转膜，封闭在5%脱脂奶粉内60 min，加入Bcl-2、Bax、p53、β-actin抗体，4 ℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育60 min，加入显色剂用于显色、显影。使用Quantity One软件分析蛋白表达量。4）ELISA检测血清SOD活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量。处死大鼠后，收集肺组织周围血清5 mL，4℃下2 000 r/min离心10 min，离心半径为3 cm，并收集各组的上清液，然后按照ELISA试剂盒说明书步骤，检测各组SOD活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组内间比较用LSD法比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织湿干比及细胞凋亡率的比较 见表1。与空白对照组相比，模型组内肺组织湿干比及细胞凋亡率显著增高（P<0.05）；与模型组相比，柴胡皂苷B2低剂量组、中剂量组、高剂量组内肺组织湿干比及细胞凋亡率显著降低（P<0.05）；与柴胡皂苷B2低剂量组相比，柴胡皂苷B2中剂量组、高剂量组内肺组织湿干比及细胞凋亡率显著降低（P<0.05）；与柴胡皂苷B2中剂量组相比，柴胡皂苷B2高剂量组内肺组织湿干比及细胞凋亡率显著降低（P<0.05）。

表1 各组大鼠肺组织湿干比及细胞凋亡率比较（%，±s）

表1 各组大鼠肺组织湿干比及细胞凋亡率比较（%，±s）

注：与空白对照组比较，∗P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与柴胡皂苷B2低剂量组比较，△P<0.05；与柴胡皂苷B2中剂量组比较，&P<0.05。下同。

组 别n 肺组织湿干比 细胞凋亡率空白对照组模型组柴胡皂苷B2低剂量组柴胡皂苷B2中剂量组柴胡皂苷B2高剂量组10 10 10 10 10 12.30±1.93 31.18±3.14*27.10±2.47#23.39±1.88#△16.71±1.49#△&7.21±0.67 32.46±3.43*26.78±2.72#20.33±2.18#△12.21±1.42#△&

2.2 各组大鼠肺组织细胞凋亡相关蛋白表达的比较 见图1，表2。与空白对照组相比，模型组内Bax、p53蛋白表达显著增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表达显著降低（P<0.05）。与模型组相比，柴胡皂苷B2低剂量组、中剂量组、高剂量组内Bax、p53蛋白表达显著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表达显著增加（P<0.05）。与柴胡皂苷B2低剂量组相比，柴胡皂苷B2中剂量组、高剂量组内Bax、p53蛋白表达显著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表达显著增加（P<0.05）。与柴胡皂苷B2中剂量组相比，柴胡皂苷B2高剂量组内Bax、p53蛋白表达显著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表达显著增加（P<0.05）。

图1 各组肺细胞凋亡相关蛋白表达

表2 各组大鼠肺组织凋亡相关蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织凋亡相关蛋白表达比较（±s）

组别空白对照组模型组柴胡皂苷B2低剂量组柴胡皂苷B2中剂量组柴胡皂苷B2高剂量组n 10 10 10 10 10 Bcl-2 0.67±0.06 0.31±0.03*0.39±0.04#0.46±0.04#△0.55±0.04#△&Bax 0.26±0.02 0.73±0.05*0.59±0.04#0.46±0.04#△0.37±0.03#△&p53 0.27±0.03 0.68±0.06*0.56±0.05#0.47±0.04#△0.35±0.03#△&

2.3 各组大鼠血清内氧化应激水平的比较 见表3。与空白对照组相比，模型组内SOD活性、GSH-Px活性显著降低（P<0.05），MDA含量显著增加（P<0.05）。与模型组相比，柴胡皂苷B2低剂量组、中剂量组、高剂量组内SOD活性、GSH-Px活性显著增加（P<0.05），MDA含量显著降低（P<0.05）。与柴胡皂苷B2低剂量组相比，柴胡皂苷B2中剂量组、高剂量组内SOD活性、GSH-Px活性显著增加（P<0.05），MDA含量显著降低（P<0.05）。与柴胡皂苷B2中剂量组相比，柴胡皂苷B2高剂量组内SOD活性、GSH-Px活性显著增加（P<0.05），MDA含量显著降低（P<0.05）。

表3 各组大鼠SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量比较（±s）

表3 各组大鼠SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量比较（±s）

组别空白对照组模型组柴胡皂苷B2低剂量组柴胡皂苷B2中剂量组柴胡皂苷B2高剂量组n 10 10 10 10 10 SOD（U/L）131.23±12.09 67.29±5.42*75.78±6.78#92.32±8.52#△117.91±10.38#△&GSH-Px（U/L）87.31±6.60 35.43±3.19*43.52±4.06#55.43±3.81#△72.84±6.47#△&MDA（μmol/L）2.40±0.44 8.44±0.89*6.92±0.53#5.29±0.41#△3.67±0.22#△&

2.4 各组大鼠血清内炎性因子水平的比较 见表4。与空白对照组相比，模型组内TNF-α、IL-1β、IL-6显著增加（P<0.05）；与模型组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组内TNF-α、IL-1β、IL-6显著降低（P<0.05）；与柴胡皂苷B2低剂量组相比，柴胡皂苷B2中剂量组、高剂量组内TNF-α、IL-1β、IL-6显著降低（P<0.05）；与柴胡皂苷B2中剂量组相比，柴胡皂苷B2高剂量组内TNF-α、IL-1β、IL-6显著降低（P<0.05）。

表4 各组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（pg/mL，±s）

表4 各组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（pg/mL，±s）

组别空白对照组模型组柴胡皂苷B2低剂量组柴胡皂苷B2中剂量组柴胡皂苷B2高剂量组n 10 10 10 10 10 TNF-α 85.38±7.21 215.89±18.40*177.45±15.32#134.22±11.48#△95.43±8.17#△&IL-1β 65.83±4.52 149.33±14.17*115.30±10.38#95.31±8.72#△74.81±6.78#△&IL-6 52.67±4.50 125.16±11.44*105.27±9.20#88.47±7.22#△63.78±5.70#△&

3 讨论

脓毒症急性肺损伤是多种因素导致的肺脏功能异常，使肺表面的活性物质降低，出现水肿、肺膨胀不全等表现［7］。目前，关于急性肺损伤的诊断方法和治疗方法相对较少，本研究通过采用LPS诱导建立脓毒症急性肺损伤动物模型，观察脓毒症急性肺损伤的发病机制。已有研究报道，LPS诱导建立急性肺损伤模型后，能改变肺组织湿干比，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6等过度释放，增加活性氧产生和降低抗氧化物酶活性，导致肺组织产生损伤［8-9］。SOD、GSH-Px属于抗氧化物酶，具清除机体内氧自由基的能力，可以反映氧化应激损伤程度［10］。MDA是一种脂质过氧化物，其含量的高低能够反映氧化损伤的程度［11］。本研究结果显示，模型组内大鼠肺组织湿干比增加，细胞凋亡率上升，凋亡相关蛋白Bax、p53蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调，SOD活性、GSH-Px活性降低，MDA含量明显增加，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌明显增加，这说明本研究用LPS诱导建立的脓毒症急性肺损伤大鼠模型构建成功。

柴胡化学成分较为复杂，有皂苷类、挥发油类、多糖类和黄酮类等，其中皂苷类化合物据今已被报道的有100多种［12］。皂苷A和D是最早从柴胡内提出分离的，皂苷B2是齐墩果二烯型衍生物，现代药理实验证明，柴胡皂苷具有多种药理活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、保肝、调节免疫等［13-14］。有研究结果显示，柴胡皂苷对大鼠肺组织具有保护用，能降低肺组织细胞凋亡数目，抑制IL-6、TNF-α和iNOS含量，减轻大鼠肺组织炎性浸润和纤维化程度［15］。高子涵等［16］研究结果发现，柴胡皂苷B2能够降低过氧化氢诱导的肝癌细胞凋亡，降低Bax蛋白表达，增加Bcl-2蛋白表达，提高肝癌细胞的抗凋亡能力。吕行直等［17］研究结果显示，柴胡皂苷B2可以降低四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤血清内MDA含量，增加SOD活性，提高机体的抗氧化能力。以上说明柴胡皂苷具有良好的抗氧化、抗炎和抗凋亡能力，但是关于柴胡皂苷B2对急性肺损伤的研究尚不清楚。本研究发现，给予注射不同剂量的柴胡皂苷B2后，能降低LPS诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织湿干比，减少细胞凋亡率，下调Bax、p53蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，促进SOD活性、GSH-Px活性，降低MDA含量，抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌，说明柴胡皂苷B2能减轻LPS诱导的脓毒症急性肺损伤。

综上所述，柴胡皂苷B2对脓毒症急性肺损伤具有保护作用，能减轻其氧化应激和炎性反应，减少细胞凋亡，但具体研究机制需要进一步探究。