NCAPG 促进成骨肉瘤细胞增殖的研究

史君，陈坤峰，李桂石，赵志坚

（1.商丘市第一人民医院急诊创伤外科，商丘 476100；2.烟台毓璜顶医院关节矫形外科，烟台 264000）

成骨肉瘤是一种侵袭性的原始骨间充质肿瘤[1]，发病率在原发性骨恶性肿瘤中居于首位，早期表现隐匿而且早期即可发生转移，一直是骨科界的难题之一[2]。非染色体结构维护亚基凝聚素Ⅰ复合物亚基G（non-structural maintenance of chromosomes condensin I complex subunit G，NCAPG）是一种有丝分裂相关的染色体凝缩蛋白，广泛存在于真核细胞中。NCAPG 在多种癌症中异常表达，且通过相关分子机制与肿瘤细胞的侵袭、转移、凋亡及耐药等过程密切相关[3-4]。以往研究发现，NCAPG 基因诱导G0/G1 细胞周期，从而促进细胞分裂[5]。在肝细胞性肝癌中，通过靶向调节NCAPG 可以抑制肝细胞性肝癌的生长和转移[6-7]，但是NCAPG 基因在成骨肉瘤中的作用尚不可知。本研究主要探讨NCAPG 基因对成骨肉瘤细胞增殖的影响及其与成骨肉瘤临床指标的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象及分组 选择商丘市第一人民医院和烟台毓璜顶医院2010 年7 月—2021 年1 月收治的成骨肉瘤患者58 例。其中，男性23 例，女性35例，年龄16～25 岁。全部病例均已经过病理证实，且具有完整的病例资料。选择患者的成骨肉瘤组织为实验组，相应配对的成骨肉瘤旁正常组织为对照组。在58 例成骨肉瘤病例中，临床分级为Ⅰ～Ⅱ级者33例，Ⅲ级者25 例；肿瘤直径＜5 cm 者22 例，肿瘤直径≥5 cm 者36 例。所有患者均接受MAP 化疗方案（大剂量氨甲喋呤+顺铂+阿霉素）治疗，所有患者均行全面术前体检，并进行了原发性肿瘤手术。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测 采用免疫组化试剂盒进行免疫组化的检测，将肿瘤组织切成约3 mm 厚，在福尔马林中固定24 h，后嵌入石蜡中，切片，每片厚度为4 μm，置于70℃环境下烤30 min，随后放入二甲苯溶液浸泡30 min 进行脱蜡，之后依次分别放入95%、85%和75%的乙醇溶液中各30 min。之后，将切片标本在PBS 缓冲液中洗涤2 次，每次2 min。之后将切片置于枸橼酸钠缓冲液中并放入微波中加热20 min 后提取抗原。然后，将切片置于室温下放置2 h，并用PBS 缓冲液洗涤2 次，每次2 min。在除去多余的水分后，切片在室温下加入H2O2后在湿箱中放置20 min，再次洗涤，滴入NCAPG 抗体（ab251864，Abcamplc，Cambridge，UK 1∶100），并在4℃环境下过夜。

次日，将切片室温放置1 h，用磷酸盐（PBS）缓冲液洗涤2 次，每次2 min。之后，在室温下滴加IgG二级抗体，静置2 h。再用PBS 缓冲液再次洗涤，滴加3，3-二氨基苯联胺（Diaminobenzidine，DAB）（用A 液和B 液预先配制），室温下染色约5～15 s。用水冲洗掉表面染料，然后用苏木精溶液染细胞核5～8 s，用水冲洗约2 min。最后，用中性树胶封片后在显微镜下观察。

免疫组化结果判定: 2 名病理医师双盲状态下，高倍镜（400×）观察肿瘤细胞，细胞核或细胞质中出现明显染色颗粒判为阳性细胞。染色程度评分规则：无染色，0 分；轻微染色，1 分；中等染色，2 分；强染色，3 分。染色细胞所占比例评分：无染色，0 分；染色面积＜25%，1 分；染色面积26%～50%，2 分；染色面积51%～75%，3 分；染色面积＞75%，4 分。最终评分为染色强度与染色面积的乘积，分数≥4 为高表达，分数＜3 为低表达。

1.2.2 试剂和仪器 抗NCAPG（ab251864，Abcam Cambridge，UK 1∶100）、山羊抗兔HRP（辣根过氧化物酶）次级抗体（ab6721，Abcam，1∶5 000 武汉proteintech 公司），IgG 二级抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。Trizol 试剂（15596026，Invitrogen，USA），β-肌动蛋白（ab179467，Abcam，1∶1 000），第一链cDNA 合成试剂盒（K1621，Thermo，USA），Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche，Switzerland）；本研究中涉及的仪器如下：ABI 7900HT QPCR Cycle，微板阅读器（ThermoMultiskanGO，USA），PVDF 膜（北京智杰方远科技有限公司）。

2 细胞实验

2.1 细胞培养、转染与分组 成骨肉瘤细胞MG-63（EMEM）用含10%FBS 和1%青霉素-链霉素双抗体的EMEM 培养，U-2 OS 用含10%FBS 和1%青霉素-链霉素双抗体的McCoy 的5a 改良培养基和1%青霉素-链霉素双抗体在37℃和5%CO 的培养箱中培养。采用基因法（中国上海）收集慢病毒载体（5′-CCAGAACCAGGCGAAGCTGGTGG-3′）和对照载体的shRNA。构建了一个慢病毒质粒pll3.7，插入shRNA 用于敲减人NCAPG。在聚烯存在的情况下，用shNCAPG 慢病毒感染MG-63（EMEM）和U-2 OS，在细胞感染慢病毒的第3 天，加入2 μg/mL 嘌呤霉素（P8230，白菌）筛选阳性细胞，始终保持药物浓度。并将未进行NCAPG 基因敲减的细胞为对照组（control 组），敲减NCAPG 基因作为实验组（shRNA 组）。

2.2 方法

2.2.1 RNA 提取和逆转录聚合酶链反应（qRTPCR） 应用Trizol 试剂从转染了NCAPG shRNA 的MG-63 细胞和U-2 OS 细胞中提取总RNA，用第一链cDNA 合成试剂盒（K1621，Thermo，Waltham，USA））合成cDNA，随后将反转录产物加入试剂盒中，使用Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）进行qPCR 实验，反应条件为94℃条件下15 s 及94℃条件下5 s 变性，60℃条件下25 s 退火，72℃条件下10 s 延展，共40 个循环。GAPDH 已经被规范化，并使用2-ΔΔCt计算方法计算相对表达式。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 中基因的引物序列Tab 1 Primers of genes in qRT-PCR

2.2.2 Western 印迹 从MG-63 和U-2 OS 细胞中提取总蛋白后，进行蛋白定量，加上样缓冲液，10%SDS-PAGE 电泳后，转移到PVDF 膜中，并在室温下用10%的牛奶阻断1 h。然后，将膜与抗NCAPG（ab251864，1∶100）、β-肌动蛋白（ab1794671∶1 000）在4℃过夜孵育。用TBST 缓冲液洗涤3 次后，用山羊抗兔HRP 二抗（ab6721，1∶5 000）孵育PVDF，PBS反复冲洗，然后加ECL 发光液，采用图像分析系统对目的条带进行扫描分析，蛋白的相对表达用相对密度表示。

2.2.3 集落形成试验 培养使用6 孔板在37℃内培养MG-63 和U-2 OS 细胞14 d。然后在室温下用多聚甲醛固定30 min，用0.2%晶紫染色20 min，并分别用PBS 洗涤。克隆细胞的数量由人工计数并绘制出来。

2.2.4 细胞增殖检测（CCK-8） 采用MTT 法确定MG-63 和U-2 OS 细胞的生存能力。将细胞培养在6 孔板上，用shRNA-NCAPG 质粒转染24 h，48 h后用MTT 溶液处理3 h，用PBS 清洗2 次后，加入150 μL 二甲基硫砜（DMSO）培养4 h。最后使用微板阅读器（ThermoMultiskanGO，美国）在570 nm 处测量光学密度（OD）。

2.3 统计学处理 采用GraphPad8.0 软件（Graph－Pad 软件，美国）进行了统计分析和图表绘制。通过Pearson 相关分析、χ2检验和Spearman 相关分析NCAPG 与成骨肉瘤之间的关系。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 免疫组化检测成骨肉瘤组织及正常组织NCAPG 蛋白的表达 与癌旁正常组织相比，成骨肉瘤中NCAPG蛋白的表达水平明显高于正常组织（图1）。

图1 NCAPG 在成骨肉瘤中的高表达（苏木精染色法，100×和400×）Fig 1 The high expression of NCAPG in osteosarcoma（hematoxylin staining，100×and 400×respectively）

3.2 NCAPG 的表达与临床病理特征的关系 结果表明，NCAPG 的表达与临床分期（P=0.042）和肿瘤大小（P=0.012）密切相关，见表2。

表2 58 例成骨肉瘤患者NCAPG 表达与临床病理特征的关系（n）Tab 2 The relationship between NCAPG expression and clinicopathological features in 58 patients with osteosarcoma（n）

3.3 定量PCR 及Western 印迹检测MG-63 和U-2 OS细胞NCAPG基因敲减后NCAPG基因及蛋白的表达 与对照组（control 组）相比，实验组（shRNA 组）NCAPG mRNA 表达水平明显受到抑制（P＜0.000 1）（图2）。

图2 定量PCR 检测MG-63 和U-2 OS 细胞NCAPG 基因敲减后NCAPG 基因的表达Fig 2 Detection of NCAPG gene expression after NCAPG gene knockdowninMG-63andU-2OScellsbyquantitativePCR

与对照组（control 组）相比，转染shRNA 组的NCAPG 蛋白表达明显低于对照组（P＜0.000 1）（图3）。

图3 Western 印迹检测MG-63 和U-2 OS 细胞NCAPG 基因敲减后NCAPG 蛋白的表达Fig 3 Expression of NCAPG protein after NCAPG gene knockdown in MG-63 and U-2 OS cells by Western blotting

3.4 敲减NCAPG 基因对成骨肉瘤细胞增殖的影响 集落形成实验结果显示，与对照组（control 组）相比，实验组（shRNA 组）MG-63 和U-2 OS 细胞的集落形成能力受到明显抑制（图4）。

图4 敲减NCAPG 基因抑制成骨肉瘤MG-63 和U-2OS 细胞的增殖Fig 4 The proliferation of osteosarcoma MG-63 and U-2 OS cells inhibited by NCAPG knockdown

CCK8 检测细胞增殖情况，结果显示，实验组（shRNA 组）MG-63 和U-2 OS 细胞的增殖能力也较对照组（control 组）明显下降（图5）。

图5 敲减NCAPG 基因抑制成骨肉瘤MG-63 和U-2 OS 细胞的增殖Fig 5 The proliferation of osteosarcoma MG-63 and U-2 OS cells inhibited by NCAPG knockdown

4 讨论

成骨肉瘤由于其高死亡率和强侵袭性，导致许多成骨肉瘤患者失去了手术切除的机会[7]。肿瘤的早期诊断是确保治疗效果的关键，但因成骨肉瘤早期缺乏特异性症状，发现时病情往往已经进一步发展。延误治疗时机、早期转移和化疗耐药等是成骨肉瘤患者生存期短、预后不佳的主要原因[8]。但是，传统的治疗方法，如放化疗疗效有限。近年来，靶向治疗因其精准性表现出极大的优势，各种治疗靶点也陆续被发现。为了改善成骨肉瘤患者的预后，需要寻找更多的治疗靶点。

在本研究中，免疫组化检测发现，NCAPG 基因在肉瘤组织中异常高表达。又通过对58 例成骨肉瘤患者的临床病理特征分析发现，NCAPG 基因的表达与肿瘤直径、分期等临床特征相关。因此，认为NCAPG基因可以作为成骨肉瘤的治疗靶点。

在本研究中发现，NCAPG 基因的高度表达与成骨肉瘤密切相关，这与之前的研究结果一致，认为NCAPG 基因与上皮性卵巢癌组织、卵巢癌细胞株、前列腺癌、儿童胶质瘤、多发性骨髓瘤等肿瘤发生密切相关[9-12]。并且NCAPG 基因的高表达与成骨肉瘤的分期和直径有关，这也与其他研究对于肝细胞癌结论高度吻合，认为NCAPG 基因呈现高表达，在癌旁组织中弱表达，且表达情况与分化程度和TNM分期密切相关[13]。

为进一步验证NCAPG 基因对成骨肉瘤的影响，用NCAPG shRNA 转染成骨肉瘤MG-63 和U-2 OS细胞，发现NCAPG 基因敲减组NCAPG mRNA 表达水平和蛋白质表达水平明显下降，并且通过CCK-8测定和集落形成实验表明抑制NCAPG 基因的表达会显著降低成骨肉瘤细胞的增殖。因此，证实了NCAPG基因可能参与了成骨肉瘤细胞的增殖。研究表明，NCAPG 基因的高表达促进多种肿瘤细胞的增殖，如在肝细胞性肝癌中，通过靶向调节NCAPG 可以抑制肝细胞癌的增殖[5]，证实NCAPG可以作为一种新的、有前景的肿瘤治疗靶点。

在肝细胞癌中，NCAPG 通过磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B 信号通路发挥作用[12-13]。在贲门腺癌中，NCAPG 通过促进cyclins（CDK4、CDK6 和cyclin D1）过表达和下调细胞周期抑制剂（P21 和P27），调控细胞异常凋亡[6]。但是NCAPG 促进成骨细胞瘤进程的机制尚待进一步探讨。

综上所述，NCAPG 基因可能是促进和介导成骨肉瘤进展的内在机制。在成骨肉瘤组织，NCAPG 基因的表达明显上调，并且通过敲减NCAPG 基因，成骨肉瘤细胞的增殖速度明显下降，因此，可以通过抑制NCAPG 基因的表达来治疗成骨肉瘤改善患者预后。但本研究也存在一定局限性，单中心、小样本弱化了这一结论，因此需要更多的体内、体外研究进一步验证结论。