心肌缺血预适应大鼠循环血微囊泡中miRNAs表达谱分析

赵俊玉，祝倩，尚曼，李烨仪，刘淼，王艺璐，吴艳娜，刘艳霞，宋君秋

（天津医科大学基础医学院药理学系，天津 300070）

心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤是导致缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD）患者心肌组织损伤加重的主要原因，缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）被认为是减轻心肌I/R损伤的一种有效治疗策略[1]。研究发现，IPC 能够诱导损伤的心脏细胞释放细胞微囊泡（microvesicles，MVs）和外泌体等细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），介导IPC 抗心肌I/R 损伤的心脏保护作用[2]。MVs 是细胞受到组织缺氧、氧化损伤等外来刺激后，以出芽的方式从质膜脱落后形成的具有脂质双分子层结构的囊泡，直径100～1 000 nm，主要通过携带 蛋 白 质、 细 胞 因 子、RNAs 和 microRNAs（miRNAs）等物质到靶细胞，发挥细胞间通讯的作用[3]。研究表明，循环血中的miRNAs 主要富集在MVs 等EVs 中，而MVs 作为载体运输miRNAs 时，不仅可以促进miRNAs 在细胞间的信息传递，而且可以保护miRNAs 免受细胞外RNA 酶的降解，提高miRNAs 的稳定性[4]。前期研究已经证明缺血预适应循环血中MVs（IPC-MVs）可能通过抑制心肌细胞内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）信号通路，发挥抗心肌I/R 损伤的保护作用[5]。但在基因水平上，IPC-MVs 抗心肌I/R 损伤的作用机制还未完全阐明。本研究利用Microarray 分析IPC-MVs 中含有的miRNAs，并利用生物信息学分析并筛选核心靶基因，拟从miRNAs 水平初步探讨IPC 抗心肌I/R损伤的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 实验动物：健康雄性Wistar 大鼠，8～10周，体重（230±12）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[批号：11400700316046，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006]。实验试剂：枸橼酸钠（天津市光复科技发展有限公司），Gene Expression Wash Pack（Agilent），miRNA complete Labeling and Hyb Kit（24×）（Agilent）。仪器：BL-420E 生物功能实验系统及HX-100E 型小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司），Optima L-100XP 制备型超速离心机（Beckman Coulter），HT 7700 透 射 电 子 显 微 镜（transmission electron microscope，TEM，HITACHI 公司），杂交炉（Agilent G2545A），PCR 仪（ABI 9700）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌IPC 模型的建立 采用简单随机抽样方法将大鼠随机分为两组：Sham-MVs 组和IPC-MVs 组，每组4 只，麻醉后取仰卧位固定，连接心电图仪，颈动脉插管监测平均动脉压（MAP），而后行开胸处理。（1）Sham-MVs 组：于冠状动脉左前降支（LAD）下穿线后旷置45 min，立即自腹主动脉取血。（2）IPC-MVs 组：LAD 下穿线后稳定15 min，再行缺血5 min/再灌注5 min 的处理，循环3 次后立即自腹主动脉取血。

1.2.2 循环血中MVs 的提取及形态鉴定 上述两组血液样本经枸橼酸钠抗凝，室温条件下，采用两步离心法收集无血小板血浆（platelet-free plasma，PFP）：2 600×g 离心15 min；取上清，10 000×g离心5 min。将PFP 置于超速离心管中，4℃，100 000×g离心148 min，弃去上清，获得沉淀即为MVs。用无菌生理盐水重悬沉淀，BCA 法测定蛋白质浓度；分装，-80℃冷冻保存。采用TEM 对MVs 进行形态学鉴定。

1.2.3 MVs 中总RNA 的提取与纯化 采用miRNeasy kit（Qiagen，German），参照说明书标准操作流程提取MVs 中总RNA，利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量，通过Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）检测RNA 完整性。

1.2.4 miRNAs 芯片分析 采用Agilent Rat miRNAs，Release 21.0（8*15K，Design ID:070154）芯片进行实验。具体操作如下：分别取两组总RNA 100 ng，定容至2 μL，去磷酸化后，加入DMSO 使其变性，随后用Cyanine-3-CTP（Cy3）进行荧光标记，RNA 纯化后和芯片杂交，55℃，20 r/min，滚动杂交20 h。杂交完成后在洗缸中洗脱。利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）进行图像扫描，获得芯片结果。

芯片结果分析：采用Feature Extraction 软件（version10.7.1.1，Agilent Technologies）处理原始图像提取原始数据。Genespring 软件（version14.8，Agilent Technologies）进行quantile 标准化和差异miRNAs 筛选，上调或者下调倍数变化值（FC）绝对值≥2.0 且P≤0.05 纳入标准。

1.2.5 荧光定量PCR（qRT-PCR）验证差异表达的miRNAs 采用qRT-PCR 技术验证芯片检测结果的可靠性。使用miScript 逆转录酶试剂盒（Qiagen，Germany）进行逆转录，使用QuantiFast® SYBR®Green PCR Kit（Qiagen）对miRNAs 进行定量。PCR扩增条件：95℃变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，30～45 个循环。每个样品重复3 次。以U6 作为内参，采用ΔΔCt 法进行相对分析。

ΔΔCt=（CtTargetmiRNAs-CtU6）IPC-MVs -（CtTargetmiRNAs-CtU6）Sham-MVs。

1.2.6 差异表达miRNAs 的生物信息学分析 通过TargetScan、miRWalk 和microRNA.org 数据库预测差异表达miRNAs 的潜在靶基因，利用Cytoscape 软件（version3.1.1）建立miRNA-mRNA 调控网络图，分析差异表达miRNAs 与潜在靶mRNA之间的关系。通过DAVID 网站对差异表达miRNAs 的潜在靶基因进行基因本体研究会数据库（GO）、生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）分析和KEGG富集分析，预测差异表达miRNAs 主要影响的生物学功能或通路。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.00 进行统计学分析，符合正态分布的计量数据采用±s 表示，两组间比较采用配对t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IPC-MVs 的形态学鉴定及RNA 含量分析 通过低温超速离心法可在大鼠循环血中成功提取得到IPC-MVs。负染法处理IPC-MVs 后，于TEM 下观察，IPC-MVs 呈圆形或椭圆形的膜性结构，平均直径100～1 000 nm，其内容物中未见明显的细胞器结构（图1A）。

RNA 定量结果显示，IPC-MVs 组中含有的总RNA 浓度为（1.13±0.06）g/ L，其中miRNAs 的含量占其总RNA 的（57.00±4.24）%，Sham-MVs 组中含有的总RNA 浓度为（1.88±1.00）g/L，miRNAs 的含量占总RNA 的（53.00±2.05）%（图1B）。

图1 IPC-MVs 的形态学鉴定及RNA 含量分析Fig 1 Identification of morphology and RNA content analysis of IPC-MVs

2.2 循环血MVs 中差异表达miRNAs 的筛选及qRT-PCR 验证 采用Microarray 筛选循环血IPCMVs 组和Sham-MVs 组中差异表达的miRNAs。选取P＜0.05，差异倍数（Fold change）绝对值≥2 且具有统计学意义的miRNAs 定义为显著性差异表达的miRNAs。聚类分析结果显示，与Sham-MVs 组相比，IPC-MVs 中有5 个表达差异显著的miRNAs（P＜0.01，FER＜0.05）（图2A），其中miR-1-3p、miR-378b、miR-133a-3p 和miR-133b-3p 表达显著上调，miR-702-3p 表达显著下调（图2B）。

qRT-PCR 结 果 显 示，miR-1-3p、miR-378b、miR-133a-3p、miR-133b-3p 和miR-702-3p 在IPC-MVs 组和Sham-MVs 组中均有表达。与Sham-MVs 组相比，miR-1-3p（t=3.194）、miR-133a-3p（t=3.002）、miR-133b-3p（t=3.389）显著上调，表达趋势与芯片结果一致。但miR-378b、miR-702-3p表达与芯片结果趋势相反，表现为miR-378b（t=4.455）下调，miR-702-3p（t=6.443）上调（图2C）。芯片检测与qRT-PCR 共同验证的结果表明，循环血MVs 中差异表达显著的miRNAs 共3 个：miR-1-3p、miR-133a-3p 和miR-133b-3p，且其在IPC-MVs 中的表达量均显著高于Sham-MVs。

图2 循环血中MVs 差异表达miRNAs 的筛选及qRT-PCR 验证Fig 2 Screening and qRT-PCR validation of miRNAs differentially expressed in MVs of circulating blood

2.3 差异表达miRNAs 的靶基因预测 通过TargetScan、miRWalk 和microRNA.org 网站对差异表达显著上调的3 个miRNAs 进行靶基因预测，共得到86 个潜在靶基因（图3A）。为进一步探究这些潜在靶基因与疾病的关系，利用Cytoscape 软件建立miRNA-mRNA 网络调控图（图3B），通过度值（Degree）大小筛选核心靶基因，并利用STRING 数据库构建靶基因之间的PPI 网络，Cytoscape 可视化分析结果显示度值排名前10 的核心靶基因为：Ntrk2、Rasd2、Igf1、Vamp2、Eif4a1、Gnai3、Sumo1、Cacna1b、Camk4、Bcl2l1（图3C）。其中Ntrk2、Igf1、Gnai3、Bcl2l1 均与心肌I/R 损伤密切相关，而且与miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p 均有潜在的靶向关系。

图3 差异表达的miRNAs 靶基因预测Fig 3 Target genes prediction of differentially expressed miRNAs

2.4 GO 和KEGG 通路富集分析 进一步对筛选出的86 个潜在靶基因进行生物学功能分析。GO 分析结果显示，这些靶基因主要参与33 个生物学过程（图4A）、25 个细胞成分的组成（图4B）和11 个分子功能（图4C）。其中前10 个核心靶基因的生物学过程主要富集在细胞增殖的正向调节、小GTP 酶介导的信号转导、蛋白质运输、应对缺氧反应和细胞对胰岛素刺激的反应等；细胞成分主要富集在细胞质、膜、细胞外泌体、胞质和细胞连接等。分子功能主要富集在蛋白结合、肌凝蛋白结合、钙调蛋白结合和蛋白激酶结合中。KEGG 信号通路富集结果显示，这些差异表达的miRNAs 靶基因显著富集在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和Ras 信号通路（图4D）。其中MAPK 信号通路涉及核心靶基因Ntrk2、Cacna1b，Ras 信号通路涉及核心靶基因Igf1、Bcl2l1。

图4 差异表达的miRNAs 靶基因GO 和KEGG 分析Fig 4 GO and KEGG analysis of differentially expressed miRNAs target genes

3 讨论

近年来研究发现，MVs 参与调控IPC 的心脏保护作用。MVs 从细胞质膜脱落过程中会携带许多母体细胞的活性物质，而不同的细胞类型、不同的刺激因素，MVs 释放时所携带的活性物质组成有所不同。在心肌缺血或缺氧期间，心肌组织中某些特定miRNAs（如miR-1、miR-133、miR-139、miR-208 等）的表达迅速受到干扰，干预心肌缺血性损伤的诊断和治疗[6]。作为有效载体，在缺血性心脏病患者循环血中的MVs 可以将具有生物学功能的miRNAs 转运至内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞或成纤维细胞内，通过与靶细胞受体结合而发挥生物学效应[7]。本实验采用梯度差速离心法，成功地从循环血样本中提取到IPC-MVs 和Sham-MVs，TEM 观察到MVs呈现圆形或椭圆形的双层膜囊泡样结构。提取两组MVs 中总RNA，结果显示IPC-MVs 和Sham-MVs 中均含有一定浓度的RNA，其中miRNAs 的含量平均占总RNA 的50%以上，表明IPC-MVs 可以是miRNAs的运输载体，为IHD 提供了一种新的治疗策略。

为进一步探究IPC 处理对循环血MVs 中miRNAs 表达的影响，采用Microarray 对IPC-MVs 及Sham-MVs 中所含miRNAs 进行初步差异筛选。结果显示，两组MVs 中5 种miRNAs 表达有显著差异。与Sham-MVs 相比，IPC-MVs 中miRNAs 显著上调4 个：miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p、miR-378b，下调1 个：miR-702-3p。为进一步分析Microarray 结果的可靠性，本研究采用qRT-PCR 进行验证，结果显示，IPC-MVs 中miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p 相对表达量显著升高，与Microarray 结果一致。由于miR-378b 和miR-702-3p 芯片检测与qRT-PCR 验证结果不一致，可能因为这两个miRNAs 在循环血MVs 中含量较低，导致检测结果的不稳定性，暂不纳入本实验的后续研究。研究显示，这些差异表达显著上调的miRNAs 均与心血管疾病的发生、发展有一定的关联。MiR-133a-3p 和miR-133b-3p 是心肌组织中特异性表达的miRNAs，具有调节心肌细胞分化、增殖和成熟的作用。当发生缺血性损伤时，心肌内miR-133a-3p和miR-133b-3p 显著降低。心脏祖细胞中过表达的miR-133a-3p 可以促进新生血管的形成和心肌细胞的增殖，显著改善心肌梗死大鼠的心脏功能[8]；通过抑制巨噬细胞迁移因子来上调急性心肌梗死大鼠模型中miR-133a-3p，间充质干细胞来源的外泌体可有效促进血管生成、抑制细胞凋亡、减少心肌纤维化面积和改善心脏功能[9]。彭兴等[10]体外和体内研究表明，增加I/R 损伤大鼠或H/R 心肌细胞中miR-133b-3p 的表达，可以显著抑制心肌细胞凋亡和活性氧簇积累。表明miR-133a-3p 和miR-133b-3p 的过表达在心肌I/R 损伤中具有较高的治疗价值。心肌特异性miR-1-3p 在心肌细胞生长中发挥关键的调节作用。促进miR-1-3p 的释放可以有效增强间充质干细胞（MSC）的心脏分化能力，恢复梗死心肌功能[11]。但也有研究显示，miR-1-3p 具有促心肌细胞凋亡的作用，显著降低I/R 处理大鼠心脏中抗凋亡蛋白Bcl-2，增加心肌损伤[12]。因此，miR-1-3p 的过表达是否可以作为IPC-MVs 心肌I/R 损伤的治疗靶标有待进一步研究。本实验发现，与Sham-MVs 组相比，IPC-MVs 组中miR-133a-3p、miR-133b-3p 及miR-1-3p 表达显著升高，显示了IPC 处理产生的IPC-MVs 通过携带这些特异性的miRNAs 作用于靶细胞，升高损伤心肌组织中的miRNAs 水平，从而减轻心肌I/R 损伤的可能性。

靶基因预测结果显示，miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p 的潜在靶基因共86 个，利用Cytoscape 软件筛选出4 个与心肌I/R 损伤相关的共同核心靶基因：Ntrk2、Igf1、Gnai3 和Bcl2l1。生物学功能分析显示，这些潜在靶基因的表达产物主要富集在细胞质中，参与细胞增殖的正向调节、小GTP酶介导的信号转导、蛋白质运输、应对缺氧反应和细胞对胰岛素刺激的反应等生物学过程，主要参与MAPK 信号通路和Ras 信号通路，与心血管疾病的发生和发展密切相关。Ntrk2 又称为原肌球蛋白相关激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB），是神经营养酪氨酸受体激酶家族的成员之一，通过调节MAPK、Ras、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和钙信号通路，在IHD 中发挥重要的作用。Gong 等[13]研究显示，过表达心肌保护蛋白Caveolin-3，可以激活下游TrkB 信号通路，减轻糖尿病引起的心肌I/R 损伤。激活TrkB 信号通路，可以有效抑制H2O2诱导的H9c2 细胞线粒体过度分裂，从而增加细胞活力，减少细胞凋亡[14]。Igf1 是一种多功能生长因子，可以激活PI3K/Akt 信号通路促进细胞增殖和存活[15]。通过抑制Igf1 降解，骨髓间充质干细胞以缺氧诱导因子-1α 依赖机制，显著增加梗死心肌血管的生成，改善心脏功能，提高急性心肌梗死后干细胞治疗的有效性[16]。Gnai3 是多种跨膜信号通路的调制者和转导者，参与调节细胞内Ca2+信号级联反应，改善心力衰竭大鼠的心脏重塑[17]。Bcl2l1 是位于线粒体外膜的抗凋亡蛋白Bcl-2 家族成员之一，具有控制线粒体活性氧的产生和细胞色素C 释放的生物学功能，在I/R 诱导的心肌损伤中发挥抗凋亡作用[18]。本实验前期研究表明，IPC-MVs 主要通过上调心肌组织中Bcl-2 的表达，下调Bax 和降低caspase-3 的活力，减轻I/R 大鼠心肌损伤[19]。表明IPC-MVs 通过抑制心肌细胞内I/R 诱导的细胞凋亡通路，发挥心脏保护作用。因此，在IPC-MVs 中表达显著升高的miRNAs（miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p）可能通过调控Ntrk2、Igf1、Gnai3、Bcl2l1 的表达，影响心肌细胞的增殖、存活和血管生成等生物学进程，进而发挥抗心肌I/R 损伤的保护作用。本研究发现，循环血IPC-MVs 与Sham-MVs 携带的miRNAs 确实存在明显的差异表达，差异表达的miRNAs 与I/R损伤时心肌保护作用相关，这为IPC-MVs 通过转运miRNAs 治疗心肌I/R 损伤提供了理论依据，深入的机制还需进一步研究。