胰腺癌组织中星形胶质细胞上调基因-1、性别决定区Y框蛋白2的表达及与患者临床特征和微血管密度的关系△

张海燕，吴红芳，王静，张冬云

1南阳医学高等专科学校第一附属医院病理科，河南 南阳 473000 2南阳医学高等专科学校病理教研室，河南 南阳 473000

在恶性肿瘤相关死亡中，胰腺癌死亡的占比日益提高，患者的5年生存率很低，且在过去几十年中改善有限，胰腺癌高病死率归因于早期诊断困难、缺乏对可疑胰腺肿块进行评估的标准和胰腺癌生物学标志物[1]。近年来，随着分子医学的不断发展，探讨胰腺癌发生、进展、侵袭相关的靶点和调控通路可能有助于为肿瘤治疗开辟新的道路。有学者发现，星形胶质细胞上调基因-1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）、性别决定区Y框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX2）在多种恶性肿瘤中具有重要作用[2-4]。但相关转录因子对胰腺癌进展、侵袭的影响仍需进一步研究。同时，肿瘤细胞的增殖和生长依赖于新生血管生成[5]。研究发现，胰腺癌组织中微血管密度（microvessel density，MVD）明显高于癌旁组织，且MVD与胰腺癌的病理类型、临床分期、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度密切相关[6]。本研究探讨胰腺癌组织中AEG-1和SOX2的表达情况及与患者临床特征和MVD的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1月至2020年12月经手术治疗的胰腺癌患者的病历资料。纳入标准：①符合原发性胰腺癌的诊断标准[7]，经病理检查确诊为原发性胰腺癌；②接受手术治疗；③术前未接受过放化疗等抗肿瘤治疗；④年龄＞18岁。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②既往有胰腺手术史；③使用过抗血管生成药物。依据纳入和排除标准，本研究共纳入80例患者。其中，男59例，女21例；年龄44～70岁，平均（58.36±9.21）岁；导管腺癌57例，腺泡细胞癌10例，腺鳞癌5例，胶样癌3例，黏液性囊腺癌2例，印戒细胞癌2例，未分化癌1例；肿瘤部位：胰头39例，胰体17例，胰尾24例。收集患者的胰腺癌组织80例和癌旁组织80例。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情并签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学染色方法

采用免疫组织化学染色法检测胰腺癌组织和癌旁组织中AEG-1、SOX2的表达情况和MVD。制作石蜡组织切片，二甲苯脱蜡4次，依次采用95%、90%、85%、70%梯度乙醇水化，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗；3%过氧化氢室温孵育20 min，消除内源性过氧化物酶活性；采用0.125%胰蛋白酶抗原修复液微波下进行抗原修复，PBS冲洗；滴加适当比例稀释的一抗（兔抗人AEG-1抗体/兔抗人SOX2抗体），对照组以PBS代替一抗，37℃孵育60 min，4℃孵育过夜，室温放置30 min，PBS冲洗；加入二抗，室温放置30 min，PBS冲洗后，滴加即配显色剂显色，显色时间为5～10 min，出现背景色时终止显色，自来水充分冲洗；苏木素复染8 s，自来水冲洗，盐酸乙醇分化2 s，氨水返蓝1 s，脱水透明，中性树胶封片。采用血管内皮标志物CD34进行染色，应用Weidner法计数，将棕黄色的内皮细胞（簇）视为单个计数血管。

1.3 结果判定

AEG-1蛋白位于细胞质内，阳性颗粒呈棕黄色；SOX2蛋白位于细胞核内，阳性颗粒呈棕黄色。在200倍光学显微镜下随机观察5个视野。根据阳性细胞比例评分：阳性细胞比例＜5%为0分，5%≤阳性细胞比例＜25%为1分，25%≤阳性细胞比例＜50%为2分，50%≤阳性细胞比例＜75%为3分，阳性细胞比例≥75%为4分。根据染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕色为3分。总分=阳性细胞比例评分+染色强度评分，总分＜2分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为阳性（++）、6～7分为强阳性（+++），阳性和强阳性为高表达[8-9]。在100倍光学显微镜下寻找5个血管密度最高的区域，在400倍光学显微镜下计数血管密度，取平均值即为MVD。

1.4 观察指标

比较胰腺癌组织和癌旁组织中AEG-1、SOX2的表达情况，分析胰腺癌组织中AEG-1、SOX2表达与胰腺癌患者临床特征和MVD的关系。分析胰腺癌组织中AEG-1、SOX2高表达的影响因素。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验，等级资料的比较采用秩和检验；两个变量的相关性采用Spearman相关性分析；采用二元Logistic回归分析法进行多因素分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织和癌旁组织中AEG-1、SOX2表达情况的比较

胰腺癌组织和癌旁组织中AEG-1、SOX2表达情况比较，差异均有统计学意义（Z=4.171、7.218，P＜0.01）。（表1、2）

表1 胰腺癌组织和癌旁组织中AEG-1表达情况[n（%）]

表2 胰腺癌组织和癌旁组织中SOX2表达情况[n（%）]

2.2 不同临床特征胰腺癌患者胰腺癌组织中AEG-1、SOX2高表达率的比较

不同年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、TNM分期胰腺癌患者胰腺癌组织中AEG-1、SOX2高表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。低分化、有淋巴结转移胰腺癌患者胰腺癌组织中AEG-1高表达率分别高于中高分化、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=5.389、5.056，P＜0.05）；低分化、有淋巴结转移胰腺癌患者胰腺癌组织中SOX2高表达率分别高于中高分化、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=7.020、4.297，P＜0.05）。（表 3）

表3 不同临床特征胰腺癌患者胰腺癌组织中AEG-1、SOX2高表达情况

2.3 胰腺癌组织中AEG-1、SOX2高表达影响因素的多因素分析

Logistic回归分析结果显示，低分化、有淋巴结转移均是SOX2高表达的独立危险因素（OR=1.347，95%CI：1.073～1.691，P=0.011；OR=2.202，95%CI：1.754～2.763，P=0.000）；低分化、有淋巴结转移均不是AEG-1高表达的独立危险因素（OR=1.958，95%CI：0.790～4.852，P=0.147；OR=2.989，95%CI：0.599～14.913，P=0.182）。

2.4 不同AEG-1、SOX2表达情况胰腺癌组织中MVD的比较

AEG-1、SOX2高表达胰腺癌组织中MVD均明显高于AEG-1、SOX2低表达的胰腺癌组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表4）

表4 不同AEG-1、SOX2表达情况胰腺癌组织中MVD的比较

2.5 AEG-1、SOX2表达与MVD的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，AEG-1、SOX2表达均与MVD呈正相关（r=0.513、0.486，P＜0.01）。

3 讨论

AEG-1是一种能够强烈促进肿瘤发生发展的肿瘤蛋白，然而AEG-1促进肿瘤发生发展的具体机制仍不确定。研究显示，AEG-1能够通过与C-Jun氨基末端激酶和乙酰转移酶P300复合物相互作用，促进C-Jun乙酰化和染色质重塑，从而促进血管生成和胶质瘤细胞存活[10]。Ding等[11]研究显示，AEG-1在非小细胞肺癌的发生发展中发挥重要作用，且与肿瘤新生血管生成密切相关。因此，AEG-1可能具有介导肿瘤新生血管生成的作用。SOX2是位于染色体3q26.3-q27的胚胎转录因子，它在维持多能干细胞的分化和自我更新中具有重要作用，且与多种恶性肿瘤相关[12]。研究显示，SOX2过表达会显著上调细胞周期蛋白D1水平，维持肺鳞状细胞癌的生长[13]。肿瘤生长和侵袭均与肿瘤新生血管生成关系密切，因此本研究采用免疫组织化学染色法检测胰腺癌组织中AEG-1、SOX2的表达情况，并通过血管内皮标志物CD34探讨AEG-1、SOX2与血管生成的关系。

本研究结果显示，胰腺癌组织和癌旁组织中AEG-1、SOX2表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；低分化、有淋巴结转移胰腺癌患者胰腺癌组织中AEG-1、SOX2高表达率分别高于中高分化、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），低分化、有淋巴结转移均是SOX2高表达的独立危险因素（P＜0.05），表明AEG-1、SOX在胰腺癌发展和侵袭中均具有重要意义。本研究中，低分化、有淋巴结转移均不是AEG-1高表达的独立危险因素，推测其原因是本研究纳入的样本量有限，胰腺癌组织中AEG-1低表达者例数较少，造成研究结果偏倚。肿瘤细胞的侵袭、转移是恶性肿瘤重要的生物学特征，低分化肿瘤细胞的恶性程度高、增殖能力强，其侵袭和转移能力更强[14]。体外实验显示，AEG-1表达水平与基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达水平相关，下调AEG-1的表达可明显抑制胰腺癌细胞系AsPC-1细胞的侵袭和体外成瘤能力[15]。因此，在胰腺癌的发生发展过程中，AEG-1高表达患者的基质金属蛋白酶水平上升，胰腺癌细胞更具有侵袭性，更易发生淋巴结转移。黄仕灵等[16]研究显示，AEG-1能够通过上调细胞中自噬相关蛋白和上皮-间充质转化相关蛋白的表达，导致肿瘤的增殖和转移风险升高。而SOX2作为一种转录因子能够协同诱导成纤维干细胞向多能干细胞转化，从而调控肿瘤细胞的生长，参与胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移过程[17]。还有研究发现，SOX2通过诱导基质金属蛋白酶和磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[18]。SOX2能够结合snail家族转录抑制因 子 1（snail family transcriptional repressor 1，SNAIL）的启动子区域，促进肿瘤相关基因的表达，并显著抑制上皮钙黏素的表达，从而促进上皮-间充质转化和肿瘤细胞转移[19]。刘扬帆等[20]研究显示，下调微小RNA（microRNA，miRNA）-135a的表达能够抑制SOX2的表达，从而抑制人喉癌上皮细胞的恶性生物学行为，使其增殖活性、细胞集落数、迁移与侵袭能力均显著降低。因此，AEG-1与SOX2可能是胰腺癌侵袭转移过程中多条信号通路的靶蛋白，抑制AEG-1与SOX2的表达有助于使胰腺癌患者获益。

本研究结果还显示，AEG-1高表达的胰腺癌组织中MVD更高，AEG-1能够促进肿瘤细胞微血管生成，为肿瘤细胞的增殖、成瘤提供条件，其具体机制可能与AEG-1激活核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信号通路有关，NF-κB是Toll样受体3（toll like receptor 3，TLR3）信号转导通路中的关键因子，可上调多种下游靶基因的表达，产生多种功能蛋白，参与调节肿瘤细胞生长、代谢、凋亡、血管生成等生物学功能[21]。本研究结果显示，AEG-1表达与胰腺癌组织中MVD呈正相关。八聚体结合转录因子4是诱导和维持细胞多能性的主要调节因子，SOX2与八聚体结合转录因子4表达异常与多种恶性肿瘤的生物学行为密切相关[22]。SOX2-八聚体结合转录因子4复合体共同形成了核心转录调节系统，也是WNT/β-连环蛋白信号通路的必要因素，因此当SOX2高表达时，各类黏膜上皮分化失去稳态，促进肿瘤发生，同时也会导致肿瘤微血管生成和肿瘤细胞浸润等[23]。本研究中，SOX2高表达的胰腺癌组织中MVD更高，且与MVD呈正相关，支持上述结论。本研究虽获得一定结论，但仅是一项单中心研究，且仅做免疫组织化学检测，对于AEG-1、SOX2与MVD的关系及其分子机制还需进一步研究予以验证。

综上所述，胰腺癌组织中AEG-1、SOX2高表达，且与胰腺癌的分化程度、淋巴结转移情况有关，AEG-1、SOX2表达与MVD均呈正相关。