高分辨率熔解曲线技术在筛查琥珀酸半醛脱氢酶缺陷症致病基因突变中的应用

董昭樱，张新杰，支秀芳，范文轩，张玉琴，舒剑波，蔡春泉，李 东

琥珀酸半醛脱氢酶缺陷症（succinate semialdehyde dehydrogenase deficiency，SSADHD）是一种罕见的代谢紊乱性疾病，常染色体隐形遗传，主要受醛脱氢酶5家族成员A1基因（aldehyde dehydrogenase 5 family member A1 gene，ALDH5A1）所影响。这种疾病会妨碍γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的正常降解并导致4-羟基丁酸 （γ-hydroxybutyric，GHB）在尿液和脑脊液中的累积。SSADHD在临床表型上具有高度异质性，没有典型的临床表征，有的患者无明显临床症状，有的患者则表现为非常严重的神经系统损伤。对SSADHD致病基因ALDH5A1的基因突变筛查，将有助于SSADHD的诊断、治疗及后续研究。高分辨率熔解（high resolution melting，HRM）曲线是近年来开始流行且发展很快速的一项基因突变筛查技术，其高灵敏度可检测出基因中单个碱基的差异。该研究以之前发现的4例SSADHD患儿及其亲属为研究对象，拟利用一代测序结果，建立HRM曲线法对ALDH5A1热点致病基因突变位点c.1529C>T的快速筛查方法，并随机对80例患儿样本进行筛查分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 临床材料

4例SSADHD患儿既往已报道[1]，现病史简述如下。先证者1，86 d男性患儿，因间断抽搐2个月余，加重2 d入院；24 h脑电图未见异常；头MRI示双侧额、顶叶片状稍长T2信号，脑室、脑外间隙增宽，双侧上颌窦黏膜增厚；遗传代谢病尿筛查提示GHB尿症。先证者2，4个月男性患儿，因精神运动发育落后就诊；24 h脑电图未见异常；头MRI示脑室、脑外间隙增宽；遗传代谢病尿筛查示GHB尿症。先证者3，8个月女性患儿，因精神运动发育落后就诊；头MRI示脑室脑沟增宽，髓鞘发育延迟；肌电图示神经电图正常。先证者4，7个月男性患儿，因反复抽搐、发热入院；头MRI示中脑及双侧基底节区对称性长T1、长T2信号病变。80例患儿样本均来自天津市儿童医院生物样本库，年龄（7.5±3.9）岁；其中男性48例，女性32例；均无基础病。

1.1.2 主要仪器与试剂

HRM试剂选用Forget-Me-NotTMEvaGreen qPCR Master Mix（货号31042-1；Biotum，美国）。血DNA提取试剂盒为Blood Genomic DNA MiniKit（康为世纪生物科技有限公司，中国）。

仪器及分析软件选用LightCycler®480高通量实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）系统（Roche，美国）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

用EDTA抗凝管收集患者外周血2 mL，然后用Blood Genomic DNA MiniKit提取基因组DNA。

1.2.2 ALDH5A1基因测序

参考笔者所在课题组之前针对ALDH5A1的10个外显子所设计的测序用引物[2]，委托金唯智生物科技有限公司进行引物的合成及后续的基因测序。测序结果与GenBank中美国国家生物信息中心参考序列（NM_001080.3/NP_001071.1）进行比对分析。

1.2.3 建立高分辨率熔解曲线的突变筛查方法

（1）PCR引物设计：应用Primer Premier5软件针对ALDH5A1第10外显子中c.1529设计HRM曲线引物，正向引物5'-CATGGTTGGCGTCAACGAAGG-3'，反向引物5'-ATCAATGCCATACTTGGACCCCTC-3'。

（2）扩增产物大小103 bp，PCR总体积为20μL，其中Mix 10μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板5 ng，用ddH2O补齐。反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，共45个循环。PCR完成后直接进行HRM曲线分析。HRM曲线分析参数：95℃1 min，40℃1 min，数据收集从65℃~95℃，温度上升为1℃/s，且每高1℃进行25次数据采集。将所获取的数据进行HRM曲线和差异图分析。

2 结果

2.1 ALDH5A1基因突变分析

对4例先证者ALDH5A1上10个外显子分析并测序。在先证者1的DNA标本中只检测到c.1529C>T的纯合突变，其母亲为该位点的杂合携带者，其父亲正常，怀疑非生物学父亲或存在单亲二体性；在先证者2的DNA标本中同样只检测到c.1529C>T的纯合突变，父母双方均杂合携带；在先证者3的DNA标本中检测到复合杂合突变c.1529C>T和c.1383-2delA，前者遗传自母亲，后者遗传自父亲。在先证者4的DNA标本中检测到复合杂合突变c.691G>A和c.1529C>T，前者遗传自母亲，后者遗传自父亲。见图1。

图1 4例先证者在ALDH5A1第10外显子上的基因突变测序结果Fig.1 Sequencing results of variants in exon 10 of ALDH5A1 of 4 probands

2.2 高分辨率熔解曲线建立情况及80例随机样本的筛查结果

选取先证者家系中c.1529位点纯合突变基因型T/T、杂合突变基因型C/T和正常基因型C/C进行扩增，第10外显子序列信息（图2）。扩增产物的HRM曲线良好，没有非特异性产物出现。完善已有4例先证者家系中所有成员，针对ALDH5A1中该位点进行PCR-HRM曲线分析，其结果与测序结果相一致。HRM曲线分析对于此位点有良好的检出效果。80例随机患儿样本HRM曲线分析结果与先证者家系中正常基因型CC的HRM曲线相吻合（图3），说明80例患儿样本没有此位点的纯合突变和杂合携带。

图2 ALDH5A1的PCR-HRM曲线引物及c.1529突变位点Fig.2 PCR-HRM curve primers and c.1529 mutation of ALDH5A1

图3 80例儿童ALDH5A1上c.1529的HRM曲线筛查结果Fig.3 HRM curve screening results of c.1529 of ALDH5A1 in 80 children

3 讨论

SSADHD在临床上可分为早发型和晚发型，但这并不意味着晚发型患者的症状更轻，此病病程进展缓慢，有随着年龄的增加病情愈发严重的情况[3]。有研究表明，在已确诊的23例患者中就有7例在早期生活中表现与正常人无异，且没有任何临床症状[4]。SSADHD的确诊主要依靠尿液或血液中有机酸的分析[5]。但是在新生儿期GHB在尿液中的累积并不显著升高，虽然随着患儿年龄的增长会有所变化，但这个的水平变化不足以给予患者明确诊断[4]。这些都为临床诊断带来了不小的困难。而明确致病基因突变位点，对热点突变进行筛查，将有助于SSADHD的诊断治疗及后续研究。

与SSADHD有关的致病基因现今为止只发现了ALDH5A1[6]，位于6号染色体短臂上22.3区，总长度超过38 kb，其中开放阅读框1 605 bp，包含10个外显子，共编码535个氨基酸。有研究发现ALDH5A1上不同的突变位点对琥珀酸半醛脱氢酶的活性及稳定性的影响是不同的[7]。而且不同地区、不同人群中ALDH5A1基因突变谱有很大的不同。在2003年有文献[8]对全球范围内54个无亲缘关系的家系进行整理，总结了35个ALDH5A1的致病基因突变，其中26个点突变，4个插入，5个缺失。在26个点突变中有7个影响剪切位点的突变，7个无义突变，12个错义突变。到2014年，又有8例病例家系被报道[9]并在原有基础上增加了9个新的致病基因突变位点，关于SSADHD的致病基因突变谱也一直在不断增加补充中。该病在中国内地很少见，只有很少的案例被报道过[9~11]。在2015年北京大学第一医院报道了4例年龄分布在50 d~1岁的SSADHD患儿，以及6个在ALDH5A1上的新致病基因突变[12]，其中就有c.1529C>T突变。琥珀酸半醛脱氢酶位于线粒体上，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖性的酶，而c.1529C>T这个错义突变就位于NAD结合区域，当正常的胞嘧啶被胸腺嘧啶所替代后，将会引起所编码的蛋白由丝氨酸（Ser）到苯丙氨酸（Phe）的转变（p.Ser510Phe），即中性氨基酸被非极性疏水性氨基酸替代，查询ClinVar显示此突变为意义未明[13]。笔者研究中4例先证者也同样带有c.1529C>T位点突变，推测此位点可能为津冀地区SSADHD儿童患者一种常见的且重要的致病突变。

HRM曲线技术是近几年新兴的可用于基因突变鉴定的新技术，具有灵敏度高、特异性强和快速、简便、成本低等优势。在HRM曲线检测技术中PCR和HRM曲线分析这两个步骤可以在同一个平板上进行，实现了完全的闭管操作，降低了污染风险的同时节省了时间。HRM曲线技术筛查致病基因突变已经成功被应用于多种遗传性疾病的检测中，包括蚕豆病、成骨不全、地中海贫血、多囊肾病等[14~17]。而国内外还没有应用HRM筛查SSADHD ALDH5A1致病基因突变的报道，笔者研究致力于应用HRM曲线的方法来对SSADHD中热点致病变异c.1529C>T进行筛查，使其成为筛查的一种有效手段。