MUM1/CD138双染在不孕症合并慢性子宫内膜炎病理诊断中的表达情况分析*

李军红，赵朋月，魏素姣，王 芳

(郑州大学附属洛阳中心医院：1.病理科；2.生殖医学科，河南 洛阳 471000)

慢性子宫内膜炎(CE)是指子宫内膜的慢性炎症，以子宫内膜间质中浆细胞浸润为特征[1]。在不孕症患者中的发生率可高达57%[2]。不孕症患者合并CE的临床症状轻微或无症状，确诊主要依赖组织病理学核查，诊断的“金标准”为子宫内膜间质中查见浆细胞[3]。传统苏木素-伊红(HE)染色法对浆细胞的分辨困难，容易造成CE的漏诊，从而导致不孕症患者反复植入失败和复发性流产。本研究通过比较HE和免疫组织化学(免疫组化)多发性骨髓瘤致癌蛋白1(MUM1)/多配体蛋白聚糖-1(CD138)双染2种方法在不孕症合并CE中的诊断价值，以及浆细胞计数与妊娠结局的关系，以期为临床诊疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 选取2019年1-12月因不孕症在本院行宫腔镜子宫内膜诊刮术的活检标本567份作为研究对象。本研究经本院伦理委员会审核通过。

1.1.2仪器与试剂 所用单克隆抗体CD138(MI15)、MUM1(MUM1p)均为即用型工作液，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。显色系统分别为Ultra View Universal AP Red及Ultra View Universal DAB，均购于罗氏公司。仪器为罗氏全自动免疫组化染色仪(Benchmark ULTRA)。

1.1.3纳入标准 (1)已婚，月经周期规律,诊断为原发或继发不孕症；(2)有规律性生活；(3)未接受过辅助生殖助孕技术助孕；(4)术前签署本研究知情同意书。

1.1.4排除标准 (1)合并其他宫腔畸形及肿瘤性病变；(2)女性激素异常；(3)男方弱精、少精或无精。

1.2方法

1.2.1标本收集与制作 所有患者均在月经结束后3～7 d行宫腔镜检查及子宫内膜活检术。标本取检后立即置入4%中性福尔马林固定6～24 h，常规脱水，石蜡包埋，4 μm连续切片，分别进行HE和免疫组化MUM1/CD138双染。

1.2.2判读标准 分别由2名高年资病理医师进行双盲判读，有分歧的病例在多头显微镜下共同商量确定。

1.2.2.1HE染色判读标准 子宫内膜间质中出现核呈偏心性、染色质呈车轮状或钟面状等典型浆细胞特征的细胞判读为阳性，无典型浆细胞出现判读为阴性。

1.2.2.2免疫组化MUM1/CD138双染判读标准 以MUM1细胞核出现棕褐色、CD138细胞膜/细胞质出现红色，且着色在同一个细胞上判读为阳性，不着色、仅细胞质着红色或仅胞核着棕褐色均判为阴性。

1.2.3浆细胞计数 计数20个高倍镜(HPF)下阳性浆细胞数(个/20 HPF)，子宫内膜息肉视野中的浆细胞不纳入计数范围。

1.2.4治疗、妊娠情况及分组 对病理检查诊断为CE的患者进行1个疗程的一线药物治疗(多西环素，每天2次，每次口服100 mg，连续治疗14 d)。选取其中行人工辅助生殖技术并获得随访妊娠结局的患者278例(术后通过门诊或电话随访3～15个月)，根据妊娠结局分为妊娠组(183例)和非妊娠组(95例)。

1.2.5观察指标 比较HE和免疫组化MUM1/CD138双染2种方法诊断CE的差异和2组患者浆细胞计数的差异。

2 结 果

2.1HE染色及免疫组化MUM1/CD138双染判读结果 见图1、2。

箭头处指阳性浆细胞。

箭头处指阳性浆细胞。

2.2HE染色和MUM1/CD138双染对CE的诊断率比较 567份标本中HE染色诊断CE 217例(诊断率为38.3%)，MUM1/CD138双染诊断CE 354例(诊断率62.4%)，MUM1/CD138双染诊断率明显高于HE染色，差异有统计学意义(χ2=186.368，P=0.001)。见表1。

表1 HE染色和MUM1/CD138双染诊断CE结果比较(n)

2.3妊娠组与非妊娠组患者浆细胞计数比较 278例患者中妊娠183例(65.8%)，MUM1/CD138双染浆细胞计数为6(1，30)个/20 HPF；278例患者中非妊娠95例(34.2%)，MUM1/CD138双染浆细胞计数为0(0，5)个/20 HPF，妊娠组患者MUM1/CD138双染浆细胞计数明显高于非妊娠组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

与非妊娠组比较，aP<0.05。

3 讨 论

近年来，有研究发现，CE与不孕症、复发性流产和反复种植失败密切相关，因此，在生殖临床医学研究领域备受重视。CE引起的子宫内膜的持续性慢性炎症状态可导致局部免疫微环境紊乱、免疫调节因子、细胞黏附因子、炎症因子及趋化因子等失调，最终导致胚胎种植失败。目前认为，CE最主要致病因素为宫腔微生物感染，针对病因使用抗菌药物治疗可明显改善患者生殖预后[2-5]。由于CE的临床症状轻微且无特异性，因此对CE的诊断帮助不大[6-7]。CE的病理形态学特征为黏膜表层水肿样改变、间质细胞密度增加、腺上皮细胞及间质中成纤维细胞成熟分离和内膜间质中浆细胞浸润[3]。100多年前HITSCHMAN等[1]提出将子宫内膜间质中出现浆细胞作为病理检查诊断CE的“金标准”，至今几乎所有CE相关的研究均沿用了此标准。其分子生物学证据为子宫内膜中存在许多免疫调控细胞，但携带抗原体的淋巴细胞却很少在子宫内膜的功能层中出现，然而在CE患者的子宫内膜中发现B淋巴细胞可浸润内膜的基底层和功能层，可能的原因是微生物激发了内膜的免疫反应，诱导了B淋巴细胞的迁移，进而B淋巴细胞受影响分化成了子宫内膜间质中的浆细胞[1]，因此，浆细胞的识别成为CE诊断的关键。传统HE染色对浆细胞的识别较困难，且存在与子宫内膜间质细胞或单核细胞难以区分的情况，常导致诊断不足。如何在不孕症患者子宫内膜诊刮标本中更精准地识别浆细胞、提高CE的诊断率，并在此基础上有针对性地进行规范化抗感染治疗提高患者受孕成功率是临床和病理医师面临的共同挑战。

CD38、CD138、MUM1均是目前病理检查诊断中常用的识别浆细胞的抗体。CD38是转膜糖蛋白中的Ⅱ型，在活化的B淋巴细胞、前B淋巴细胞、胸腺细胞、浆细胞中均有表达。CD138是浆细胞最特异的指标,大约95%石蜡切片中浆细胞膜表面均有CD138表达[8-9]，同时，也会在前B淋巴细胞和上皮细胞表达。MUM1也称为干扰素调节因子4，是由人类6号染色体上的干扰素调节因子4基因编码的转录因子，主要表达在浆细胞、活化的B淋巴细胞和T淋巴细胞。国内有研究表明，CD38和CD138在CE的诊断中具有重要价值[10-12]。在实际工作中单独使用CD38或CD138会造成一定程度的假阳性，MUM1作为识别子宫内膜中浆细胞的标志物具有比CD138更高的灵敏度[8]，单独使用也存在假阳性的问题。另据文献报道，免疫组化CD38、CD138联合使用有助于提高浆细胞的识别准确率[13]，但需在2张免疫组化切片上对同一靶细胞进行判读，不仅受细胞定位偏差及切片切面变化影响，而且非常耗时。

为更准确地识别浆细胞，本研究引入了免疫组化MUM1/CD138双染技术。该技术是一种先进的免疫组化染色方法，以不同的酶系统催化不同显色底物呈现不同颜色，从而在同一切片上同时显示2种不同的抗原表达[14]。该方法在宫颈病变及肿瘤脉管侵犯的诊断中应用较广泛，且取得了满意的效果[15-16]。

MUM1/CD138双染是专门为诊断CE设计的抗体组合，只有靶细胞的细胞核和细胞质同时表达MUM1和CD138 2种抗体才能作为识别浆细胞的可靠证据。这种双染技术定位准确，使浆细胞的识别更加清晰，且比单独使用单一抗体具有更好的特异性。本研究结果显示，MUM1/CD138双染判读CE的诊断率(62.4%)明显高于HE染色(38.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)，提高了子宫内膜炎的检出率，与郑捷等[17]采用的MUM1/CD38双染技术比较，MUM1/CD138双染对浆细胞的识别特异性更强。

由于MUMI/CD138双染对浆细胞的细胞核和细胞质进行了双重标记，定位准确、清晰，极大地提高了浆细胞判读的准确性和可重复性，不仅有利于判读，而且便于计数，为进一步研究浆细胞计数在CE诊治中的半定量分析奠定了基础。陈玉清等[18]研究表明，在未经抗感染治疗接受辅助生殖技术的患者中非CE组术后1年内累积妊娠率明显高于CE组，表明CE很可能是不孕患者的病因之一。梁荣丽等[13]研究表明，对CE阳性组和CE可疑组患者干预治疗后阳性组患者妊娠率高于可疑组，与本研究结果有类似之处，显示有针对性地抗感染治疗能改善子宫内膜的炎症状态，从而提高CE阳性患者妊娠率。

本研究结果进一步显示，诊刮子宫内膜标本中浆细胞数与妊娠结局相关，妊娠组患者浆细胞计数明显高于非妊娠组，差异有统计学意义(P<0.05)。推测可能的原因为浆细胞计数高的CE患者对一线药物治疗更敏感，经规范抗感染治疗能显著改善其生殖预后[3]；按查见浆细胞大于或等于1个/20 HPF诊断为CE的患者中部分患者浆细胞计数偏低(<5个/20 HPF)，推测其不孕原因可能并非主要为炎症所致，故而一线抗感染治疗不能明显改善其生殖预后，其不孕原因可能与非CE患者类似，另有其他因素。根据本研究结果，推荐浆细胞大于或等于5个/20 HPF作为一线抗感染治疗的截断值，避免浆细胞计数偏低的CE患者过度治疗。

本研究尚有需完善之处：(1)本研究样本量不大，尚有待于扩大样本量进一步研究。(2)浆细胞数在不孕症合并CE的诊断中尚未有统一标准[10,18-19],加之辅助生殖技术成本较高，为避免患者因炎症因素未规范治疗导致助孕失败，本研究定义CE的标准为查见浆细胞大于或等于1个/20 HPF，相较于部分文献[3，10，20]采用浆细胞大于或等于5个/20 HPF的标准更加宽松。(3)本组定义为CE的患者在给予辅助生育技术前均进行了1个疗程的一线药物治疗，抗感染治疗后未再次进行子宫内膜活检对比浆细胞计数情况。(4)本研究发现浆细胞计数需排除宫腔镜可见的典型息肉样病变，仅在非息肉区域的子宫内膜组织中进行计数。有研究表明，部分子宫内膜息肉中浆细胞计数偏高，但其影响不孕的原因可能与息肉导致的子宫内膜不规则出血、机械性阻止精子通过、免疫因素抑制精子穿过透明带等有关[21]，慢性炎症并非其关键因素，息肉摘除是其首选治疗方案[22]。

综上所述，免疫组化MUM1/CD38双染识别浆细胞定位准确、清晰，可作为诊断不孕症合并CE的可靠依据，能显著提高不孕症合并CE的诊断率；浆细胞计数高的患者不孕原因与子宫内膜炎症的关系更大，对浆细胞大于或等于5个/20 HPF的CE患者进行一线抗感染治疗能有效改善其生殖预后，但更深机制及量化关系尚有待于扩大样本量进一步研究。