蒜氨酸体外抗菌机制的研究*

裴天容，李明强

(1.遵义医科大学第一附属医院急诊科，贵州 遵义 563003；2.遵义医科大学微免实验室，贵州 遵义 563003)

大蒜为百合科，葱属植物的地下鳞茎，早期以食物调味剂进入人们的生活，已有千年历史。大蒜素抗菌作用开启了大蒜生物活性成分的研究进程，大蒜素具有抗菌、抗肿瘤、抗衰老、降低血脂血糖、调节免疫功能、防治心血管疾病、改善血液循环等多种生物学活性[1-4]。大蒜素包括二烯丙基一硫化合物、二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物、二烯丙基四硫化合物等几种含硫化合物，具有独特的臭味和刺激性，均为脂溶性物质[5]。大蒜素脂溶性特征导致大蒜素注射液配制必须使用有机溶剂、助溶剂、增溶剂等，故而带来了不良反应[6]。局部高浓度大蒜素的刺激性引起局部组织炎性反应，导致组织细胞受损[7-8]，以致大蒜素注射液临床应用受限，疗效达不到预期效果。为此人们将目光转移到大蒜素前体物质——水溶性蒜氨酸。蒜氨酸与蒜酶同时使用引起蒜氨酸的药理作用研究，在进行蒜氨酸药理作用研究过程中采用蒜氨酸、蒜氨酸加蒜酶、大蒜素进行对比实验发现，蒜氨酸的药理作用显著低于蒜氨酸加蒜酶、大蒜素的药理作用[9-11]。同时，蒜氨酸与蛋白非特异性结合影响实验结果[12]，影响人们对蒜氨酸的研究进程，更未见蒜氨酸体外抗菌机制的相关文献报道。本研究探讨了蒜氨酸在机体外的抗菌机制，以提高人们对蒜氨酸的认识，旨在为推动蒜氨酸的开发研究提供帮助。

1 材料与方法

1.1材料 2020年3月从农贸市场购买紫皮大蒜参照文献[13]方法分离提取蒜氨酸，分离的蒜氨酸经化学分析、紫外光谱分析、红外、质谱和核磁共振波谱等鉴定结果与文献[13]记载一致。配制成100 mg/mL蒜氨酸溶液，调节pH值至7.4备用。菌种为金黄色葡萄球菌(金葡菌)CMCC(B)26003、白色葡萄球菌(白葡菌)CMCC(B)26101、大肠杆菌CMCC(B)44102、伤寒杆菌CMCC(B)50037等。杜氏改良Eagle培养基(DMEM)培养液购于上海立菲生物技术有限公司(货号：C11995500BT)，异硫氰酸荧光素(FITC)购于苏州亚科科技股份有限公司(货号：3326-32-7)，BCA蛋白浓度测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司(货号:PC0020),青霉素购于中诺药业有限公司(批号：0121804114)，二抗购于Sigma公司(货号：G7402)。超薄切片机生产厂家为Leica(型号Leica UC7)，钻石切片刀生产厂家为Daitome(型号Ultra 45°)，透射电子显微镜生产厂家为HITACHI(型号HT7800/HT7700)。

1.2方法

1.2.1微量稀释法检测蒜氨酸最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度 参照文献[14]的方法，细菌用大肠杆菌、伤寒杆菌、金葡菌、白葡菌16 h斜面培养物，无菌生理盐水洗下菌苔，配制成0.5个麦氏单位菌液，再用DMEM培养液进行20倍稀释，调至5×105CFU/mL，1 h内使用。蒜氨酸稀释：用96孔板，每一块板8排，每排12孔，每个蒜氨酸浓度40个复孔，22个浓度孔，大肠杆菌、伤寒杆菌、金葡菌、白葡菌4种细菌各做10个复孔。每孔加入DMEM培养液100 μL，从第1孔开始至第2排最后一孔，100 mg/mL蒜氨酸溶液100 μL加入第1孔，混匀后吸取100 μL加入第1孔混匀，倍比稀释至第1排第10孔，第10孔混匀后吸取100 μL丢去，微量反应板上对蒜氨酸浓度进行倍比稀释，第1孔浓度为50 000 μg/mL，第2孔浓度为25 000 μg/mL，第3孔浓度为12 500 μg/mL，第4孔浓度为6 250 μg/mL，第5孔浓度为3 125 μg/mL，第6孔浓度为1 563 μg/mL，第7孔浓度为781.3 μg/mL，第8孔浓度为390.1 μg/mL，第9孔浓度为195 μg/mL，第10孔浓度为97.510 μg/mL，第11孔浓度为48.750 μg/mL，第12孔浓度为24.380 μg/mL，第13孔浓度为12.190 μg/mL，第14孔浓度为6.094 μg/mL，第15孔浓度为3.047 μg/mL，第16孔浓度为1.524 μg/mL，第17孔浓度为0.762 μg/mL，第18孔浓度为0.386 μg/mL，第19孔浓度为0.193 μg/mL，第20孔浓度为0.096 μg/mL，第21孔浓度为0.048 μg/mL，第22孔浓度为0.024 μg/mL，第23孔为阳性对照，第24孔为培养基对照。第1孔至第2排第11孔每孔加入上述准备好的5×105CFU/mL菌液100 μL，第2排第11孔为细菌正常生长，阳性对照；第2排第12孔加入DMEM培养液100 μL为培养基对照，盖好板盖37 ℃培养24、48、72 h观察结果。24 h结果观察后用接种环挑取1环培养液划线接种平板培养基(血液琼脂或伊红美蓝培养基)。抑菌试验培养板继续培养72 h，分别收集第0孔至MIC孔培养液和阳性对照孔培养液，用荧光免疫技术检测菌体表面结合蒜氨酸情况。

1.2.2免疫荧光检测抑菌菌体表面蒜氨酸抗原

1.2.2.1FITC兔抗蒜氨酸荧光抗体的制备 利用本实验室分离提取蒜氨酸免疫家兔制备多价抗体，参照文献[15-17]进行抗体纯化与FITC标记。

1.2.2.2抗体纯化 取蒜氨酸免疫兔血清50 mL用0.06 mol/L pH 4.0醋酸盐缓冲液调节pH值为4.5。按每毫升血清逐滴加入正辛酸至终质量浓度为25 μL/mL，室温下充分搅拌30 min，10 000 r/min离心30 min取上清液，用0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)调节pH值至7.4，每毫升上述混合液加0.277 g固体硫酸铵，4 ℃搅拌30 min，5 000 r/min离心15 min，沉淀溶于0.005 mol/L氯化钠溶液，装入透析袋，置相同溶液中透析，每6 小时更换透析液1次，直至用奈氏试剂检测透析液中无铵离子存在。采用BCA蛋白测定试剂盒测定抗体蛋白质量浓度，并调整质量浓度为1 mg/mL球蛋白。

1.2.2.3FITC标记抗体 取抗体蛋白总量为1 mg适量溶液用0.3 mol/L碳酸钠溶液调节抗体溶液pH值至9.0，加入适量二甲基亚砜溶解FITC至终质量浓度为0.25 mg/mL，于室温避光振荡反应1 h，再加入1 mL DPBS、1 mL 4%聚乙二醇8000和1 mL 3%氯化钠沉淀标记的抗体，5 000 r/min离心15 min，重复2次。用0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶解沉淀即为FITC标记的家兔抗蒜氨酸抗体。

1.2.2.4蒜氨酸抗原检测 采用微量稀释法经72 h培养后用无菌吸管吸取板孔中培养液于小试管中，1 000 r/min离心10 min，取上清液于10 mL离心管中，加入甲醛溶液至终浓度10%，室温静置30 min，4 000 r/min离心20 min，弃上清液留取沉淀，用生理盐水洗涤3次，用100 μL pH 7.4 PBS分散细菌，涂片、干燥、甲醇固定。在涂片上加入FITC兔抗蒜氨酸荧光抗体，湿盒中37 ℃培养1 h，用pH 7.4 PBS冲洗干净，冷风吹干，于荧光显微镜下观察结果。

1.2.3免疫电镜观察蒜氨酸在菌体内的分布

1.2.3.1标本准备 大肠杆菌和金葡菌12 h斜面培养物，用生理盐水洗下菌苔，4 000 r/min离心20 min，离心洗涤3次，配制成9×109个/mL细菌浓度，分别分为2份，一份按每毫升加入100 mg/mL蒜氨酸溶液0.2 mL充分混匀，静置30 min，加入甲醛溶液至终浓度为10%，静置30 min，4 000 r/min离心20 min，离心洗涤3次，配制成9×1010个/mL细菌浓度，为蒜氨酸阳性标本。另一份不加蒜氨酸处理，作为阴性对照。2份均4 000 r/min离心20 min，沉淀物用免疫电镜固定液固定。标本经清洗、脱水、树脂渗透、包埋、聚合等处理后进行70～80 nm超薄切片予4 ℃保存备用。

1.2.3.2免疫标记 镍网从4 ℃取出用超纯水悬浮5 min，清洗、封闭后加入1∶5稀释的兔抗蒜氨酸抗体覆盖标本后4 ℃过夜孵育；室温复温后用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗3次，每次5 min；加入二抗，室温孵育 20 min后转37 ℃烘箱孵育 1 h，然后转室温复温0.5 h。实验过程中防止干片。用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗5次，每次5 min，超纯水清洗5次，每次5 min；采用铀复染后用70%乙醇清洗3次，超纯水清洗3次；烘干，透射电子显微镜下观察并采集图像，黑色10 nm大小的金颗粒即为阳性表达。

2 结 果

2.1蒜氨酸体外抗菌结果 采用微量稀释法培养24 h，4种细菌光密度(OD)值均呈现以第1孔最高，逐渐下降至OD值最低；大肠杆菌最低OD值为第14孔(1.16±0.09)，伤寒杆菌最低OD值为第13孔(0.94±0.06)，金葡菌最低OD值为第17孔(0.15±0.02)，白葡菌最低OD值为第17孔(0.19±0.03)，然后又逐渐上升至阳性对照孔，形成一个V型曲线。见表1、图1。4种细菌OD值比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较以最低OD值孔为蒜氨酸对该菌的MIC。同时，第14孔蒜氨酸稀释浓度为6.094 μg/mL，加入菌液后的最终质量浓度为3.047 μg/mL，因此，蒜氨酸对大肠杆菌的MIC值为3.047 μg/mL，由此蒜氨酸对伤寒杆菌的MIC值为6.094 μg/mL，对金葡菌和白葡菌MIC值均为0.386 μg/mL。96孔板培养24 h后用接种环于各孔挑取菌液划线接种血平板和伊红美蓝培养基平板，经培养24 h平板上均有相应细菌生长。96孔板继续培养72 h，大肠杆菌和伤寒杆菌第1孔至OD值最低孔的OD值均明显低于阳性对照孔，差异均有统计学意义(P<0.05)；最低孔至阳性对照孔OD值均继续升高。金葡菌和白葡菌各孔OD值无明显变化。见表1、图2。在收集培养液时可见培养基pH明显升高，酚红指示剂颜色明显变红，可嗅到淡淡的大蒜素气味。

表1 蒜氨酸体外抑菌试验OD值

续表1 蒜氨酸体外抑菌试验OD值

图1 蒜氨酸抑菌试验24 h OD值曲线图

图2 蒜氨酸抑菌试验72 h OD值曲线图

2.2菌体表面蒜氨酸抗原检测结果 荧光显微镜下可见绿色荧光的菌体，见图3。对照孔无绿色荧光出现。革兰阴性菌的菌体表面荧光较革兰阳性菌薄，荧光强度也弱于革兰阳性菌。

2.3免疫电镜观察 蒜氨酸阳性标本可见大肠杆菌和葡萄球菌菌体表面、细胞壁、细胞内均有较多的黑色金颗粒，表明结合了较多的蒜氨酸，结合蒜氨酸处细菌细胞壁、细胞膜、菌体内容物形态与阴性对照比较未见异常表现，阴性标本未见黑色金颗粒。革兰阳性球菌表面与细胞壁黑色金颗粒较革兰阴性杆菌菌多,见图4。

A:大肠杆菌;B:葡萄球菌。

A：大肠杆菌免疫电镜蒜氨酸阳性结果；B：大肠杆菌免疫电镜蒜氨酸阴性结果；C：金葡菌免疫电镜蒜氨酸阳性结果；D：金葡菌免疫电镜蒜氨酸阴性结果。

3 讨 论

本研究采用微量稀释法结果显示，蒜氨酸对大肠杆菌MIC为3.047 μg/mL，对伤寒杆菌MIC值为6.094 μg/mL，对金葡菌和白葡菌MIC值均为0.386 μg/mL。蒜氨酸对4种细菌均无杀菌作用。

从微量稀释法培养不同时间结果分析可见第1孔至OD值最低孔OD值升高是由于蒜氨酸与大分子蛋白结合产生乳白色沉淀所致，OD值最低孔至阳性对照孔OD值升高为细菌生长所致。培养72 h大肠杆菌和伤寒杆菌由于细菌缓慢生长，导致第1孔至OD值最低孔OD值均明显低于阳性对照孔，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明第1孔至OD值最低孔蒜氨酸与蛋白结合出现乳白色结合物沉淀，导致OD值明显升高，由于细菌生长繁殖消耗大量蒜氨酸后结合蒜氨酸减少，乳白色结合物降低，OD值明显下降。最低孔OD值与阳性对照孔OD值持续升高，72 h也是持续升高，表明是细菌生长所致。革兰阳性菌由于细胞壁厚而致密、蛋白含量高结合大量蒜氨酸，严重阻断了细菌与环境的物质交换，即使延长培养时间细菌也无生长表现。24 h培养物接种相应培养基，培养鉴定出相应细菌，说明蒜氨酸体外无杀菌活性。

在收集培养液时可嗅大蒜素气味，也可见培养基pH升高，以大肠杆菌最为显著。这是由于革兰阴性菌细胞壁薄、脂质含量高而蛋白含量较低，蒜氨酸阻断细菌与环境的物质交换的严重程度较低，细菌缓慢生长繁殖分解蒜氨酸产氨使培养基pH升高，产生的大蒜素浓度不足以杀死细菌，但可增强蒜氨酸抑菌作用，同时，大肠杆菌的营养要求较伤寒杆菌低，生长速度快于伤寒杆菌，提高了蒜氨酸对大肠杆菌的抑菌效果，致使蒜氨酸对大肠杆菌MIC值低于伤寒杆菌MIC值。

免疫电镜下可见革兰阴性杆菌表面荧光层较阳性菌薄，荧光强度弱于革兰阳性球菌。免疫电镜显示革兰阴性杆菌有较厚的外膜，黑色金颗粒较少；革兰阳性球菌具有坚硬、厚实的细胞壁肽聚糖层，具有较多的黑色金颗粒，与免疫荧光检测结果吻合。这是因为革兰阴性细胞壁外膜脂质含量高，革兰阳性菌细胞壁蛋白含量高，蒜氨酸与蛋白质非特异结合，所以，革兰阳性菌黑色金颗粒较革兰阴性菌多。由于蒜氨酸与细胞壁及外膜中蛋白结合，使蛋白空间构象改变，从而改变了细胞壁与细胞膜的通透性，阻断了细菌与环境物质交换，抑制了细菌生长、繁殖，以致革兰阳性菌MIC值(0.386 μg/mL)显著低于革兰阴性杆菌MIC值(3.047 μg/mL)。免疫电镜观察到菌体内均有黑色金颗粒，是因为蒜氨酸为小分子氨基酸类物质，因被动转运进入细胞内。同时，蒜氨酸与菌体内功能蛋白(如酶蛋白)结合抑制细菌生命活动，具有较强的抑菌作用。由于革兰阳性菌与革兰阴性菌结构与化学组成不同，导致蒜氨酸与之结合存在差异，以致对不同细菌的抑菌作用也出现差异，与蒜氨酸MIC出现明显差异的结果吻合。细菌菌体内、细胞壁、细胞膜、细胞器结合蒜氨酸处的形态、结构与阴性对照比较未见异常表现，当细菌离开蒜氨酸环境表现为正常生长、繁殖，显示蒜氨酸无杀菌活性。

综上所述，蒜氨酸能与菌体蛋白质、细菌酶蛋白结合阻止细菌与环境物质交换，抑制细菌生命活动，具有较强的抑菌活性；细菌缓慢的生命活动又可分解蒜氨酸，形成大蒜素，加强蒜氨酸抑菌效应。蒜氨酸无杀菌活性。