不同分子分型的子宫内膜癌临床病理特征分析*

孙丽丽，刘格丹，贾楠，冯炜炜

200025上海，上海交通大学医学院附属瑞金医院 妇产科(孙丽丽、刘格丹、冯炜炜)；200011 上海,复旦大学附属妇产科医院 妇科(贾楠)

子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%，近20年其发病率呈上升且年轻化趋势。最新流行病学数据显示，全球范围内每年有320 000例新发病例及76 000例死亡病例[1]。我国2020年EC新发病例81 964例，死亡病例16 607例，发病率仅次于宫颈癌[2]。传统的EC分型分为I型和II型：I型为雌激素依赖型，内膜样腺癌为主要病理类型，II型以p53突变为主要特征，包括浆液性腺癌、透明细胞癌和癌肉瘤等特殊类型。目前临床上首选的治疗方案是手术治疗，根据病理类型及分期决定是否补充放化疗、化疗、激素治疗等。早期EC手术治疗预后良好，未发生转移的患者术后5年总生存率有90%，但仍有一些早期低危的患者出现复发，而高危型EC的总体生存率在50%左右，即使术后追加放化疗，中位总生存期仅37个月，中位无进展生存期仅13个月[3]。因此迫切需要基于分子特征的个体化精准治疗手段。

自从2013年TCGA数据库把子宫内膜样腺癌和浆液性癌分为四种分子分型：1)POLE超突变型(POLE ultramutated)、微卫星高度不稳定型(microsatellite instability/hypermutated,MSI-H)、低拷贝变异型/微卫星稳定型(copy number low/microsatellite stable, CNL)、高拷贝型/浆液性样型(copy number high, CNH/serous-like)后，发现分子分型能更好地预测预后[4]，之后学者们[5]开发了ProMisE分型方法分为：POLE超突变型、MMRd型(mismatch repair protein deficiency)、非特异分子谱NSMP型(no specific molecular profile)，p53异常型(p53abn)，Huvila等[6-8]发现其与TCGA分型高度吻合，但更实用，易于临床推广，基于分子特征的新型治疗方案如靶向治疗、免疫治疗、联合治疗给EC患者带来了新的希望。近期分子分型已应用到少见的病理类型(如癌肉瘤、去分化/未分化癌、透明细胞癌)中，这也有利于对这些高危型肿瘤进行个体化的术后处理和预后判断。

本研究对在上海交通大学医学院附属瑞金医院及复旦大学附属妇产科医院进行ProMisE分子分型的EC患者进行回顾性分析，探讨4种分子分型在EC中的应用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2017年8月至2022年2月上海交通大学医学院附属瑞金医院妇产科EC手术患者65例，收集2015年12月至2017年6月复旦大学附属妇产科医院EC手术患者21例。总计86例EC患者，其中66例子宫内膜样腺癌，10例浆液性癌，4例透明细胞癌(2例透明细胞癌，2例透明细胞癌合并子宫内膜样腺癌)，3例癌肉瘤，3例其他(1例腺体鳞癌、1例去分化癌、1例中肾管腺癌)。所有HE染色病理切片及免疫组化染色切片均由2名有资质的病理科医师阅片诊断。所有患者均保存完整随访及临床资料。本研究经过上海交通大学医学院附属瑞金医院及复旦大学附属妇产科医院伦理委员会批准，经患者本人知情同意并签署同意书。

1.2 方法

免疫组织化学染色法，检测MMR蛋白，包括MLH1(DAKO-IR07961，1∶100)、MSH2(DAKO-IR08561，1∶100)、MSH6(DAKO-IR08661，1∶100)、PMS2(DAKO-IR08761，1∶100)、p53(DAKO-GA61661，1∶200)、ER(DAKO-GA08461，1∶50)、PR(DAKO-IR06861，1∶50)、Ki-67(DAKO-GA62661，1∶200)，PD-L1(DAKO-M366629，1∶100)。其中4种MMR蛋白及p53结果的判读标准如下：MMR蛋白的阳性表达定位于细胞核，在肿瘤细胞完全阴性时，判读为MMR蛋白缺失，可表现为一种或多种蛋白同时缺失[9]。p53突变的判读标准包括：1)均匀一致高表达>80%，常为100%蛋白质不能被降解，堆积所致，呈弥漫性强阳(错义突变)；2)完全失表达，不能被抗体检测到(无义突变)；3)胞浆表达，C端的碱基突变，不能进入细胞核；4)肿瘤细胞呈强弱不等的差异性着色判定为野生型[10]。PD-L1： 综合阳性评分(combined positive score,CPS)的计算方法：每100个肿瘤细胞中PD-L1染色阳性的肿瘤细胞和肿瘤相关的免疫数之和。CPS<1判定为阴性，CPS≥1判定为阳性。

POLE测序方法采用二代测序，应用NEBNext®UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina®(NEB，美国)测序文库。使用Illumina软件在cBot Cluster二代测序系统中对样本进行聚类，并在 Illumina NovaSeq平台上对文库制备物进行测序。测序结果应用Chromas2.4.1软件进行分析，并与标准序列进行比对，确定POLE基因外切酶区域突变的病例。

1.3 ProMisE分子分型流程

EC患者的石蜡标本在明确病理诊断后，第1步：免疫组化检测4种MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)，发现其中一种或者多种蛋白缺失者归为MMRd组；如果MMR蛋白无缺失，行第2步：对POLE核酸外切酶第9～14号外显子区域进行测序，突变者归为POLE超突变组；对POLE无突变者行第3步：免疫组化检测p53蛋白表达，p53阳性者或失活者，判读为p53突变型，归为p53abn亚型，p53野生型则归为p53 wt亚型。具体检测流程图1如下：

图1 ProMisE分子分型流程图

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料经正态性检验符合正态分布者以(均数±标准差)表示，不符合正态分布者以中位数表示；T检验和单因素方差分析用于计算差异。计数资料以例数和百分率表示。单向无序类数据[病理类型、淋巴结转移、淋巴脉管间隙浸润(lymphovascular invasion,LVSI)、ER、PR阳性率及PD-L1等]采用卡方检验和Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EC患者临床病理特征

本研究共纳入86例行手术治疗EC患者，中位年龄57岁(范围：32～85岁)。2例行全子宫切除±前哨淋巴结活检术，1例行全子宫双附件切除+大网膜、阑尾切除术，16例行全子宫双附件切除±前哨淋巴结活检术，18例行全子宫双附件切除+盆腔淋巴结清扫±大网膜切除，36例行全子宫双附件切除+盆腔淋巴结清扫+腹主动脉旁淋巴结切除±大网膜切除术，12例行(次)广泛子宫双附件切除+盆腔淋巴结清扫±腹主动脉旁淋巴结切除±大网膜、阑尾切除术，1例行全子宫+双附件切除+直肠肿瘤切除术。86例EC患者按照FIGO分期：I期49例、II期11例、III期18例、IV期8例；其中子宫内膜样腺癌66例，非子宫内膜样癌20例(包括浆液性癌10例、透明细胞癌4例、癌肉瘤3例、其他3例，包括1例腺体鳞癌，1例去分化癌，1例中肾管腺癌)。

2.2 EC患者4种ProMisE分子分型在各种传统病理类型中的占比

86例EC患者中4种分子分型所占比例分别为：POLE突变亚型2.33%(2/86)、MMRd亚型31.40%(27/86)、NSMP亚型40.70%(35/86)、p53abn亚型25.58%(22/86)(图2)。其中，子宫内膜样腺癌66例，4种分子分型所占比例分别为：POLE突变亚型3.03%(2/66)、MMRd亚型34.85%(23/66)、NSMP亚型45.45%(30/66)、p53abn亚型16.67%(11/66)。在各分化程度的内膜样腺癌中4种分子分型的例数(表1)和占比如图3所示。

图2 86例EC，ProMisE分子分型占比

表1 86例EC分子分型和临床病理特征的关系

CharacteristicNPOLE(n=2)MMRd(n=27)NSMP(n=35)p53abn(n=22)χ2PGrade6616.9700.005 G1202 (10.00)4 (20.00)14 (70.00)0 (0) G2250 (0)9 (36.00)11 (44.00)5 (20.00) G3210 (0)10 (47.62)5 (23.81)6 (28.57)ER expression860.6121.000 Positive682 (2.94)21 (30.88)28 (41.18)17 (25.00) Negative180 (0)6 (33.33)7 (38.89)5 (27.78)PR expression863.4980.370 Positive592 (3.39)19 (32.20)26 (44.07)12 (20.34) Negative270 (0)8 (29.63)9 (33.33)10 (37.04)PD-L1 expression5912.7090.003 Positive360 (0)15 (41.67)10 (27.78)11 (30.55) Negative231 (4.35)3 (13.04)16 (69.56)3 (13.05)

浆液性癌10例中NSMP亚型占20%(2/10)、p53abn亚型占80%(8/10)。癌肉瘤3例中NSMP亚型占33.33%(1/3)，p53abn亚型占66.67%(2/3)。透明细胞癌4例中3例为MMRd亚型占75%，1例(25%)为p53abn亚型。其他类型3例，分子分型所占比例分别为：MMRd亚型33.33%(1例腺鳞癌)、NSMP亚型66.67%(1例去分化癌和1例中肾样癌均为NSMP型)(图3)。

图3 86例EC不同病理类型ProMisE分子分型占比

2.3 EC患者4种ProMisE分子分型的组织学特征的差异

如表1所示：4种分子分型患者的年龄、肌层浸润深度、淋巴结转移、ER、PR阳性比等差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。POLE、MMRd、NSMP亚型更倾向于临床早期(在FIGOI～II期中占比更高)和子宫内膜样癌类型，而p53abn型患者诊断时更多为III～IV期和非内膜样癌(P值分别为0.034和0.011)。而在子宫内膜样癌中，POLE和NSMP亚型主要为高中分化[POLE：(G1期100%，NSMP：(G1+G2)占83.33%(25/30)]；MMRd和p53abn亚型多为中低分化[MMRd：(G2+G3)占82.61%(19/23)，p53abn：(G2+G3)占100%]。

2.4 4种分子亚型与Ki-67、PD-L1表达的关系

四种分子亚型的Ki-67阳性率分别如下,POLE突变亚型:42.50%±27.50%；MMRd亚型：51.22%±4.81%；NSMP亚型：46.57%±3.35%；p53abn亚型：60.91%±4.42%，4组之间差异无统计学意义(χ2=1.748,P=0.649)。

一共59例患者做了PD-L1检测，1例POLE PD-L1阴性；18例MMRd型中：3例CPS<1，7例CPS：1～10；8例CPS>10，PD-L1阳性率(CPS≥1)为83.33%；26例NSMP亚型中：16例CPS<1，9例CPS：1～10,1例CPS>10，PD-L1阳性率为38.46%；14例p53abn型中：3例CPS<1，10例CPS：1～10，1例CPS>10,PD-L1阳性率为78.57%。MMRd亚型中PD-L1阳性率最高，且CPS>10的比例达到44.44%。其次为p53abn亚型，但此亚型中90.91%的PD-L1阳性者的CPS值仅为1～10。而NSMP型PD-L1阳性率低。

2.5 MMRd亚型中4种MMR蛋白的表达情况

27例患者中，4种MMR蛋白可单独或联合表达缺失。MLH1蛋白表达缺失率最高占55.56%(15/27)，且大多数联合PMS2表达缺失。具体为1/27例(3.70%)单纯MLH1表达缺失；13/27例(48.15%)表现为MLH1/PMS2联合表达缺失；1/27例(3.70%)表现为MLH1/MSH2联合表达缺失。其次为MSH2蛋白表达缺失(9/27,33.33%)，且多与MSH6联合表达缺失：8/27例(29.63%)表现为MSH2/MSH6联合表达缺失；1/27例(3.70%)表现为MSH2/PMS2联合表达缺失。另有1例(3.70%)表现为单纯MSH6表达缺失；2/27例(7.41%)表现为PMS2表达缺失。

3 讨 论

近年来EC分子分型逐渐在临床应用，为预后判断和治疗方案选择提供参考。我们的研究提示了子宫内膜样腺癌中POLE突变亚型占3.03%、MMRd亚型占34.85%、NSMP亚型占45.45%、p53abn亚型占16.67%。浆液性癌和癌肉瘤中主要是p53abn型,其次为NSMP型。透明细胞癌中MMRd型占75%，其次是p53abn型。从病理特征来看：POLE、MMRd、NSMP亚型更倾向于临床早期(FIGO I～II期)和子宫内膜样癌类型，而p53abn型患者诊断时更多为III～IV期和非内膜样癌。而在子宫内膜样癌中，POLE和NSMP亚型主要为高中分化，MMRd在和p53abn亚型多为中低分化。4种分子分型的PD-L1阳性率也有明显差异，MMRd型最高83.33%，p53abn型为78.57%，NSMP为38.46%。

我院子宫内膜样癌中4种分子分型的比例与第5版WHO中给出的对应比例12%、30%、40%及18%，二者在构成比上基本一致，在POLE超突变亚型中略有差距，可能与本研究的样本量较少有关。文献报道[11-12]POLE超突变亚型的典型特征包括：发生在相对年轻患者、FIGO分期早、肿瘤级别高；MMRd亚型与POLE超突变亚型相似；NSMP亚型常表现为G1、G2子宫内膜样癌；p53abn亚型包括浆液性癌及绝大多数G3子宫内膜样腺癌。本研究病例中多数特征基本与文献报道符合。也有文献报道p53abn亚型除上述特征外，经常表现为与LVSI、肌层浸润深度相关，本研究未发现其相关性，还需未来收集更多病例进行验证。

在一些少见的病理类型进行分子分型对于了解疾病的本质有更大的意义。Travaglino等[13]荟萃分析4项研究共231例子宫癌肉瘤患者，将其按TCGA分子分型进行亚组分析，发现CNH亚型在癌肉瘤中占主导地位(73.9%)。同年该研究小组[14]对73例未分化/去分化EC进行TCGA分子分型，发现MSI型占优势，为44%，POLE超突变型占12.4%，p53突变型为18.6%，p53野生型为25%。这表明其与其他高危组织学类型的EC存在关键差异。子宫内膜透明细胞癌是分子特点最不明确的组织类型，该研究小组[15]荟萃分析了5项研究中共162例子宫内膜透明细胞癌患者的TCGA分子分型，发现CNH型(42.5%)和CNL型(40.9%)最常见，而MSI型(9.8%)和POLE超突变型(3.8%)占比小。在本次研究中4例透明细胞癌3例为MMRd型，1例去分化癌为NSMP型，1例中肾样癌为NSMP型，这有助于对患者预后的判断，同时也提示某些高危型患者可能受益于免疫治疗。

免疫治疗在复发或转移性EC中已经成为推荐方案。在Keynote158研究中发现PD-1抗体(帕博丽珠单抗)治疗PD-L1阳性的转移性EC有效[16]。通过对不同分子分型的内膜癌进行PD-L1检测，可以更好地指导治疗。2021年Victoor等[17]对120例EC病例在ProMisE的基础上，联合进行全面的免疫分子分析，对CD3、CD8、PD-L1、β-连环蛋白和L1CAM进行免疫组织化学染色，发现POLE-mut型和MMRd型通常表现出更高数量的CD3+/CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)和更高的PD-L1表达。另有Talhouk等[18]在ProMisE的基础上，增加TILs和免疫抑制因子(CD3、CD8、CD79a、CD138等)的检测，发现高TILs肿瘤常见于MMRd型和POLE超突变型。在我们的研究中，MMRd型PD-L1阳性率最高83.33%，与文献报道相似，而p53abn型也有PD-L1阳性率达78.57%，提示部分高危型EC也可能获益于免疫治疗。而NSMP型由于缺乏特异的分子特征谱，治疗目前仍然以标准治疗为主，我们发现NSMP型PD-L1阳性率为38.46%，也为部分患者提供了一个治疗选择。除外PD-L1等免疫分子检测，TILs和免疫抑制因子也将成为后续研究热点，为分子分型亚分类提供理论依据。

综上所述：目前，EC的术后病理报告中不但包括分子分型，仍需要组织学分类、FIGO分级等内容，并增加免疫特征分子的检测。分子分型在临床应用中具有更客观、重复性强等特征，与传统的病理相结合，未来可用于探索添加辅助治疗的有效手段，为EC患者个体化诊断及治疗提供新策略。

作者声明：本文全部作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；并承诺论文中涉及的原始图片、数据资料等已按照有关规定保存，可接受核查。

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网(CNKI)科技期刊学术不端文献检测系统的学术不端检测。

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

文章版权：本文出版前已与全体作者签署了论文授权书等协议。