FTO通过调控CDKN2B mRNA中m6A修饰促进子宫内膜癌细胞增殖的初步研究*

张林,万一聪, 姜旖, 程文俊

210029 南京，南京医科大学第一附属医院 妇科

子宫内膜癌在妇科肿瘤中发病率居于第2位[1]。流行病学研究认为肥胖是子宫内膜癌发病的高危因素，但肥胖与子宫内膜癌发病与进展的分子机制尚不清楚[2]。目前大部分研究主要集中在讨论肥胖相关糖、脂代谢异常，表皮生长因子、胰岛素样生长因子的表达情况等[3-5]。2007年肥胖相关基因FTO(fat mass and obesity associated)首次被鉴定[6]，FTO基因敲除的小鼠皮下脂肪蓄积明显降低，但小鼠摄食无明显改变，FTO广泛参与了脂肪、能量代谢的调控[7]。2011年，FTO蛋白被鉴定为一种去甲基化酶[8]，FTO的表达可以去除mRNA中m6A (N6-methyladenosine)修饰，影响乳腺癌、恶性黑色素瘤，急性髓系白血病的进展[9]，但其在子宫内膜癌中的作用及调控机制尚未被全面认识。本研究通过检测FTO在子宫内膜癌组织中的表达及对子宫内膜癌细胞增殖功能的调控，并结合多组学测序技术，探索FTO通过m6A机制调控子宫内膜癌细胞增殖的下游关键基因。

1 材料与方法

1.1 组织芯片与免疫染色

正常子宫内膜与子宫内膜癌组织芯片购自上海芯超生物有限公司。组织切片经脱蜡、水化、抗原修复后，加入FTO抗体(Proteintech,1∶100)孵育过夜，加入HRP标记二抗(Active Motif,1∶2 000)孵育后，PBS漂洗后，DAB显色，中性树脂封片并拍照。免疫染色评分经两位病理医师进行独立打分后取平均值，免疫染色评分采用积分法，免疫评分=染色强度×阳性细胞比例。细胞染色强度：阴性(0分)、弱阳性(1分)、阳性(2分)、强阳性(3分)。阳性细胞比例：≤25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、≥75%(4分)。

1.2 RNA提取与qPCR

所有组织来自于2008～2015年于我院诊断为子宫内膜样癌的患者共96例，并使用正常子宫内膜20例作为对照。肿瘤组织均为初次手术获得，未行其他治疗，正常子宫内膜来自因子宫肌瘤而行全子宫切除术的患者。样本使用经本院伦理委员会批准(2021-SRFA-159)，所有患者均签署知情同意书。使用Trizol法提取组织RNA，经nanodrop定量后，使用逆转录试剂盒(诺唯赞)将RNA逆转录为cDNA。荧光定量PCR检测FTO基因的表达，引物序列：(FTO) F: 5′-AACACCAGGCTCTTTACGGTC-3′; R: 5′- TGTCCGTTGTAGGATGAACCC-3′；(CDKN2B) F: 5′-ACGGAGTCAACCGTTTCGGGAG-3′；R: 5′-GGT CGGGTGAGAGTGGCAGG-3′。

1.3 细胞培养与慢病毒转染

子宫内膜癌细胞株ishikawa、HEC-1-A、HEC-1-B、KLE及AN3CA均培养于MEM培养基，添加10%胎牛血清。FTO过表达与shRNA敲低慢病毒由山东维真生物有限公司设计并包装，shRNA克隆序列(shRNA1: GCAGCTGAAATATCCTAAACT;shRNA 2: GCACAAGCATGGCTGCTTATT)。 慢病毒感染细胞后，使用嘌呤霉素筛选稳定过表达与敲低FTO的细胞株，使用PCR与Western Blot验证基因表达效率。

1.4 细胞增殖实验

筛选出稳定高/低表达FTO的细胞株后，按5 000个细胞/孔将细胞种植于96孔板中。使用CCK-8法(碧云天)检测细胞增殖活力。按照实验设计，在指定的时间点加入CCK-8溶液，继续培养1小时后，使用酶标仪，检测450 nm吸光值。

1.5 蛋白印迹

使用RIPA裂解细胞，蛋白裂解液经超声破碎后，12 000g离心后取上清。蛋白经定量后，加入LDS上样缓冲液(Thermo Fisher)，70 ℃变性蛋白。蛋白样本经SDS-PAGE凝胶分离，经转膜、封闭，加入一抗(1∶1 000)与相应二抗后，TBST洗膜后，ECL发光液曝光。

1.6 转录组测序分析(RNA-sequencing, RNA-seq)

RNA经定量后，使用RNA文库构建试剂盒(NEB)建库，所有操作按照操作说明书进行。二代测序文库经库检后，使用nova测序仪进行双端测序，二代测序由北京诺禾生物有限公司完成。

1.7 RNA免疫沉淀与PCR(RNA immunoprecipitation and PCR,RIP-PCR)

1×107个HEC-1-B细胞经预冷PBS洗涤后，使用RIP免疫沉淀试剂盒(Millipore)进行后续实验。细胞经充分裂解后，获得上清，取5%上清液冻存作为input，剩余样本分别加入FTO抗体(Proteintech,1∶100)与IgG抗体-磁珠混合物。4 ℃孵育2小时后，使用高、低盐洗涤液洗涤共5次。蛋白酶k消化液消化磁珠，释放富集的RNA，使用RNA纯化试剂盒(QIAGEN)纯化RNA。使用逆转录试剂盒(诺唯赞)将RNA逆转为cDNA，进行后续定量PCR。

1.8 甲基化免疫沉淀与PCR(methylated RNA immunoprecipitation and PCR，MeRIP-PCR)

提取细胞中RNA后，使用片段化试剂盒(NEB)将200 μg RNA片段化到200 nt大小，取5%样本作为input。剩余样本分别加入m6A抗体(Abcam,1∶100)与IgG抗体-磁珠混合物。后续实验流程与1.7类似。

1.9 多组学测序数据分析

转录组测序数据分析使用HiSAT2软件进行RNA比对，经FeatureCounts软件定量后，DESeq2软件计算差异基因获得差异基因集，差异基因经GO与KEGG数据库进行通路富集。MeRIP-seq与RIP-seq数据获得自课题组既往发表的数据集[10]。由于FTO是一种m6A去甲基化酶，课题组重点关注敲低FTO后，m6A修饰明显增加的基因，并且这些基因也能够被FTO所富集。联合计算RNA-seq，MeRIP-seq与RIP-seq数据集中共同差异基因。

1.10 裸鼠成瘤实验

将2×106个细胞种植于裸鼠皮下并成瘤，待肿瘤最大直径达1 cm左右处死小鼠，剥除肿瘤组织，拍照并称重。组织切片经石蜡包埋、切片后，分别孵育抗FTO(Proteintech, 1∶100)与Ki67(Proteintech, 1∶500)一抗，对应HRP标记二抗(Active Motif,1∶2 000)，检测组织样本中FTO与Ki67蛋白的表达水平。

1.11 统计学分析

使用SPSS 21.0进行统计分析，使用秩和检验分析FTO蛋白在组织中的表达差异。生存分析使用log-rank检验来评估两组间生存差异。组间比较采用student-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FTO在子宫内膜癌中表达增加，并与患者预后差相关

定量PCR显示FTO基因mRNA在子宫内膜癌中表达明显增加(图1A)，免疫组织化学显示FTO蛋白在正常子宫内膜与子宫内膜癌组织中存在表达，但两者之间的表达水平存在差异(图1B)。根据样本免疫组织化学评分，热图显示FTO在正常子宫内膜中表达较低，而在子宫内膜癌中表达明显增加(图1C)。根据FTO基因mRNA表达的中位数，将患者分为高/低表达组，并绘制Kaplan-Meier生存曲线，高表达FTO的患者预后更差(图1D)。

图1 FTO在子宫内膜癌中高表达并降低患者预后

2.2 FTO促进子宫内膜癌细胞增殖

FTO蛋白在不同的子宫内膜癌细胞系中表达存在明显差异，定量PCR与Western Blot显示FTO在HEC-1-A与HEC-1-B表达较高，而在ishikawa、AN3CA及KLE细胞系中表达较低(图2A)。慢病毒载体能够有效地增强与沉默FTO基因mRNA与蛋白的表达(图2B)。我们选择FTO高/低表达的细胞系HEC-1-B及ishikawa进行后续实验。CCK-8分析显示FTO高表达能够促进子宫内膜癌细胞增殖，而沉默FTO表达能够抑制肿瘤细胞增殖(图2C、D)。裸鼠成瘤实验显示FTO高表达的细胞肿瘤更大，而沉默FTO表达后的肿瘤更小(图2E、F)。瘤体免疫组化显示FTO表达增加的肿瘤Ki-67表达更高，而沉默FTO蛋白的肿瘤Ki-67表达更低(图2G、H)。

图2 FTO促进子宫内膜癌细胞增殖

2.3 FTO通过m6A机制调控CDKN2B表达

使用shRNA沉默FTO表达后，转录组测序检测差异表达基因。共有4 391个基因表达差异有统计学意义(FC>2，P<0.01)，其中2 461个基因表达明显降低，1 930个基因表达明显上调(图3A)。GO分析显示沉默FTO与负调控细胞增殖有关(图3B)，KEGG分析也证实沉默FTO的表达能够抑制肿瘤增殖与周期相关通路(图3C)。转录组测序联合分析既往报道的FTO RIP-seq与MeRIP-seq测序数据中的共同差异基因，共有26个基因被富集，其中细胞周期负调控基因CDKN2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B,)也明显被富集(图3D)。根据MeRIP-seq显示FTO蛋白沉默后，CDKN2B基因mRNA中的m6A修饰明显增加(图3E)，定量PCR也证实FTO蛋白能够去除CDKN2BmRNA中的m6A修饰(图3F)。定量PCR与Western Blot证实FTO敲低能够促进CDKN2B基因mRNA与蛋白的表达(图3G、H)。

图3 FTO调控CDKN2B基因mRNA中m6A修饰及其表达

3 讨 论

在生理状态下，FTO在糖及能量代谢过程中发挥了关键作用，FTO的沉默导致生长迟缓和发育畸形[11-12]。此外，FTO在乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、宫颈癌等多种实体肿瘤中表达明显升高，并且其表达水平与患者的预后呈现明显负相关[13-14]，FTO的异常表达是导致肿瘤发生及进展的重要原因。我们既往报道FTO在存在转移的子宫内膜癌中表达明显增加[10]。在本研究中，我们发现FTO在正常子宫内膜腺体中有低-中度表达水平，而在子宫内膜癌中表达呈现明显升高，这提示FTO可能参与子宫内膜癌进展。

在本研究中，我们发现FTO过表达在体内和体外均能够促进肿瘤细胞的增殖，这和在胃癌、乳腺癌、急性髓细胞白血病中所报道的功能类似[13-14]。FTO的表达导致mRNA中出现异常去甲基化，影响了RNA的代谢，如mRNA核输出、稳定性、翻译效率等[8]。Li等[15]发现FTO可以抑制ASB2和RARA mRNA中的m6A修饰，降低其蛋白表达，从而促进急性髓细胞白血病的进展。Yang等[16]发现FTO可以抑制PDCD1基因UTR区中的m6A修饰，影响了mTOR信号，从而导致恶性黑色素瘤对PD-1抗体治疗的抵抗。我们也曾经报道了FTO通过m6A机制调控HOXB13的表达影响WNT信号，促进子宫内膜癌细胞转移[10]。在本研究中，我们发现了CDKN2B基因mRNA中的m6A修饰受到FTO的调控，而抑制FTO的表达能够促进CDKN2B基因RNA与蛋白的表达。

CDKN2B基因是细胞周期抑制因子，CDKN2B蛋白的表达能够抑制CDK2/4复合物的功能，使细胞退出细胞周期，抑制细胞增殖[17]。CDKN2B蛋白在多种肿瘤中均呈现表达沉默，因此，CDKN2B蛋白被认为是一种肿瘤抑制因子[18]。既往认为DNA甲基化是导致CDKN2B表达降低的重要因素，后续发现miR-15a-5p， miR-541也对CDKN2B发挥了调控作用[19]。在本研究中，我们发现FTO通过RNA甲基化调控CDKN2B基因的表达，并发挥了重要作用。这从一个新的角度展现了细胞周期的精确调控机制。

总之，在本研究中，我们发现FTO在子宫内膜癌中表达明显增加，并且能够促进子宫内膜癌细胞增殖，FTO可能通过m6A依赖的方式调控CDKN2B基因的表达，促进子宫内膜癌细胞增殖。

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