整合素α 5与卵巢上皮性癌铂类耐药SKOV3/DDP细胞增殖、侵袭和凋亡的相关研究*

韦露薇，陈国伟，莫婧，梁慧英，李力

545001 广西 柳州，柳州市工人医院 妇科(韦露薇、陈国伟、莫婧、梁慧英);530021 南宁，广西医科大学附属肿瘤医院 妇科(李力)

卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，是一种具有复杂分子和遗传变异的异质性疾病，患者死亡率高居各类妇科肿瘤的首位[1]。目前铂类结合紫杉醇类的联合化疗是卵巢癌的一线化疗方案，尽管大多数患者初期会获得良好的化疗效果，但部分患者在治疗后18 月内出现复发或转移[2]，多药耐药出现是导致卵巢癌治疗后复发、转移甚至死亡的重要原因，亦是严重制约卵巢癌患者生存率提高的瓶颈问题[3]。因此，探讨卵巢癌多药耐药的分子机制，寻找逆转化疗耐药的靶标，对改善卵巢癌治疗意义重大。我们前期通过综合生物信息学分析来筛选上皮性卵巢癌多药耐药发生过程中调控信号传导通路的关键基因发现，整合素α5(integrin α5，ITGA5)做为信号通路上游效应分子，在卵巢上皮性癌耐药过程中，通过抑制凋亡、影响下游信号通路的传导参与耐药过程[4]。因此，本研究通过深入探讨ITGA5在卵巢癌铂类耐药SKOV3/DDP细胞增殖、侵袭及凋亡中的作用，从而为卵巢上皮性癌铂类耐药治疗寻找相关靶点，为逆转铂类耐药提供新的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂耗材

本实验所用的SKOV3细胞株存储于本实验室中[5]，SKOV3/DDP耐药株为本实验室自行建立，由亲本细胞SKOV3通过持续暴露于浓度递增的顺铂中建立而来[6]。其中完全培养基包括1640(Gibco,USA)、10%胎牛血清 (CORNING,USA)，2 μmol/L L-glutamine, 100 U/mL penicillin, and 100 μg/mL streptomycin (Gibco BRL,Grand Island,NY)，在5% CO2培养箱中37℃恒温孵育。LV-ITGA5-RNAi干扰病毒(上海吉凯制药技术有限公司)、细胞计数试剂盒-8 (CCK-8;Dojindo，熊本，日本)、Transwell相关耗材。

1.2 方法

为研究卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP细胞中ITGA5的表达情况，并探讨ITGA5对卵巢上皮性癌铂类耐药的影响及可能作用机制，首先采用qRT-PCR检测卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP细胞中ITGA5表达及差异。将卵巢癌SKOV3/DDP细胞分别分为siITGA5 -SKOV3/DDP组(ITGA5沉默组)、siNC-SKOV3/DDP组(阴性对照组)和SKOV3/DDP组(对照组)，分别转染ITGA5沉默质粒siITGA5和阴性对照质粒siNC， SKOV3/DDP给予空载体，72小时后验证转染情况，并分别用CCK8法检测增殖活性、半数致死率(50% inhibitory concentration，IC50)、流式细胞术检测细胞凋亡、Transwell法检测细胞侵袭能力。

1.2.1 实时定量PCR检测ITGA5表达情况 采用 RNeasy®Mini Kit(QIAGEN,Germany)试剂盒提取SKOV3、SKOV3/DDP细胞总RNA，采用Thermo RT Kit cDNA (美国,Thermo)将总RNA逆转录成cDNA。在ABI7500进行实时定量PCR，实时定量PCR采用试剂One step SYBR primescript plus RT-PCR kit(日本TaKaRa)，反应体系为20 μL。反应条件：95℃预热10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s进行40个循环。根据基因ITGA5、GAPDH基因的cDNA序列，采用primer7设计引物，引物序列为GAPDH Forward：5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGA-3′；GAPDH Reverse：5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′；ITGA5 Forward：5′-GGCTTCAACTTAGACGCGGAG-3′；ITGA5 Reverse：5′- TGGCTGGTATTAGCCTTGGGT-3′。所有基因引物由TaKaRa生物科技公司合成。目的基因的相对表达量用2ˉ△△Ct法计算，以GAPDH为内参。

1.2.2 慢病毒感染 设计并合成了含有ITGA5表达质粒及其阴性对照(NC)、LV-3、绿色荧光蛋白报告基因的慢病毒包装。合成的慢病毒包含ITGA5和NC序列(LV3-NC)，用于感染SKOV3/DDP细胞，建立稳定的细胞系。Puro选择后获得稳定的细胞，qRT-PCR证实ITGA5表达。

1.2.3 CCK8法检测细胞IC50、增殖活性 IC50测定：将处于对数生长期的各组细胞制成单细胞悬液，细胞接种于96孔板中12小时后处理，细胞密度为2 000个/孔。将顺铂(0 μg/mL、0.39 μg/mL、0.78 μg/mL、1.56 μg/mL、3.125 μg/mL、6.25 μg/mL)溶解在100 μL DMEM,加入各孔中孵育48 h，CCK8(10 μL)添加和孵化2 h。酶标仪452 nm波长，测定每孔细胞的吸光度值(A)。抑制率=(正常对照孔A值-实验孔A值)/(正常对照孔A值-空白调零孔A值)×100%，由此计算各组细胞的顺铂抑制率。增殖活性：将处于对数生长期的各组细胞制成单细胞悬液，细胞密度为1.0×103/孔，接种于96孔板中，37℃孵育，其后在第24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h进行实验指标观测。按照CCK8说明书操作，酶标仪380 nm波长测定各组细胞的吸光度。计算各组细胞的平均吸光度值，横坐标为细胞培养时间，纵坐标为细胞吸光值，绘制各时间点的细胞生长曲线。

1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭能力 收集各组细胞制成单细胞悬液，Transwell上室每孔中加入100 μL细胞悬液，调整细胞浓度为1.5×104个细胞/孔， Transwell下室每孔中加入600 μL 20%FBS DMEM培养基，培养24小时后，多聚甲醛固定后结晶紫染色，显微镜下取9个随机视野下记膜下细胞数平均值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将各组细胞配成单个细胞悬液，按每孔含5×105个细胞接种到6孔板, 每种细胞3个重复孔。放置37℃、5%二氧化碳培养箱进行培养24小时后。将顺铂按照4个浓度加入各孔中，即：0 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL。正常对照孔加不含DDP的DMEM培养液 3 mL，放置到恒温培养箱培养48小时后。于70℃水浴30 s诱导凋亡后，分别加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD，轻柔吹打混匀避光染色15 min。用筛网过滤细胞入流式小管内，在1 h内完成流式细胞仪(激发波长Ex=488 nm)的检测。

1.3 统计学分析

使用SPSS 21.0统计软件包，荧光定量PCR实验结果数据以均数±标准差或中位数表示。计量资料比较用t检验；计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP中ITGA5表达情况

运用qRT-PCR技术分别对SKOV3及SKOV3/DDP细胞系中ITGA5 mRNA进行验证，结果显示，在铂类耐药的卵巢癌SKOV3/DDP细胞系中ITGA5相对表达量明显高于卵巢癌SKOV3细胞系，上调2.03倍，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 卵巢癌细胞SKOV3及铂类耐药细胞SKOV3/DDP中ITGA5表达水平对比(**P<0.01)

2.2 ITGA5基因沉默的效果验证

转染72小时后，运用qRT-PCR技术检测siITGA5-SKOV3/DDP细胞系中ITGA5相对表达量均显著低于siNC-SKOV3/DDP和SKOV3/DDP组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示ITGA5基因沉默成功。

2.3 ITGA5对siITGA5-SKOV3/DDP细胞IC50的影响

由CCK8实验可见，实验组(siITGA5-SKOV3/DDP)、阴性对照组(siNC-SKOV3/DDP)和对照组(SKOV3/DDP)，顺铂的IC50分别为2.096 μg/mL、2.507 μg/mL及2.619 μg/mL，不同组细胞的IC50差异有统计学意义(P<0.05，图2)。由此可见，ITGA5表达下调后可一定程度上改善卵巢癌铂类耐药细胞SKOV3/DDP的铂类敏感性。

图2 三组细胞对顺铂的IC50(**P<0.01)

2.4 ITGA5对siITGA5-SKOV3/DDP细胞增殖的影响

由CCK8实验可见siRNA-ITGA5感染后的(siITGA5-SKOV3/DDP)细胞增殖能力明显减弱，siITGA5-SKOV3/DDP 5天后的结果与阴性对照组(siNC-SKOV3/DDP)和对照组(SKOV3/DDP)比较，差异有统计学意义(P<0.05，图3)，而阴性对照组和空白对照组细胞生长速度差别不大。说明siRNA-ITGA5转染SKOV3 /DDP细胞后能抑制细胞生长。

图3 转染siRNA-ITGA5病毒及siRNA-NC后，三组细胞的生长曲线(*P<0.05)

2.5 ITGA5对siITGA5-SKOV3/DDP细胞侵袭的影响

通过检测Transwell小室下表面的细胞数如图4所示。结果可见，实验组细胞(siITGA5-SKOV3/DDP)细胞数明显减少，与阴性对照组(siNC-SKOV3/DDP)和对照组(SKOV3/DDP)比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而空白对照组和阴性对照组细胞数差异无统计学意义(P>0.05)，说明下调ITGA5基因可使卵巢癌SKOV3/DDP细胞侵袭能力明显减弱。

图4 三组细胞的侵袭能力比较(**P<0.01)

2.6 ITGA5对siITGA5-SKOV3/DDP细胞凋亡的影响

依据ITGA5下调后基因的siITGA5-SKOV3/DDP(实验组)的IC50值，以及预实验摸索，设置3个顺铂浓度为：1.0 μg/mL、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL，且每组均设不加药的孔作为对照。3个顺铂浓度作用于三组细胞48小时后用流式细胞仪检测顺铂不同药物浓度对其凋亡率的影响，结果见图5。可以看出随着顺铂浓度的增加，三组细胞中凋亡率都增加；当顺铂药物浓度达到1 μg/mL时，实验组细胞(siITGA5 -SKOV3/DDP)与阴性对照组及空白对照组比较，凋亡率显著上升(P<0.05)，阴性对照组(siNC-SKOV3/DDP)和对照组(SKOV3/DDP)的差别不显著。

图5 转染siRNA-ITGA5病毒及siRNA-NC后，三组细胞的凋亡率比较(**P<0.01)

3 讨 论

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤，70%患者就诊时已为晚期，发生盆腹腔广泛转移，肿瘤细胞发生侵袭、转移是影响预后的关键因素。整合素α(integrin α, ITGA)是一类重要的细胞表面黏附分子，由α/β异构形成二聚体，是一类在细胞与间质、细胞与细胞的相互作用中起关键作用的跨膜糖蛋白。细胞外基质-整合素-细胞骨架参与了多种疾病和组织的生理病理变化过程，如肿瘤生长、侵袭、转移及耐药等[7]，其中ITGA5作为家族成员中重要的信号传导通路蛋白，越来越受到关注。

研究表明组织发生恶变后ITGA5表达明显升高，且化疗耐药后ITGA5亦明显升高，如结直肠癌[8]、卵巢癌[9]、乳腺癌[10]等。进一步研究中发现，ITGA5在肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡、上皮-间质转化等过程中发挥了重要作用[11]。如在结肠癌组织中ITGA5与细胞发生上皮细胞-间充质转化相关，且在低分化结肠癌组织中的表达量亦明显高于高、中分化组织，同时ITGA5与结肠癌恶性表型及预后差相关[12]。Morozevich等[13]研究发现在耐阿霉素的乳腺癌细胞系中ITGA5异常高表达，促进了乳腺癌的侵袭和转移。在肝癌顺铂耐药研究中发现，整合素与肝癌的侵袭和转移密切相关，整合素过表达能够抵制顺铂诱导的肝癌细胞凋亡，其作用机制可能是通过活化ERK和p38来发挥抗凋亡作用[14]。整合素β1作为整合素家族一员，在既往卵巢癌铂类耐药的研究中也有相关类似的报道，细胞通过其表面的整合素β1与细胞外基质发生黏附后，抑制了顺铂诱导的细胞凋亡，参与了卵巢癌耐药的发生[15]。因此ITGA5对卵巢癌铂类耐药的作用机制有待进一步研究。

在胰腺癌患者中，亦检测到ITGA5高表达，ITGA5高表达患者，其预后明显下降，采用siRNA敲除ITGA5可以抑制人胰腺星状细胞(human pancreatic stellate cell,hPSC)的分化并减少体内的异形增生，针对ITGA5的新型拟肽AV3在3D异球形模型中抑制了hPSC活化并增强了吉西他滨的抗肿瘤作用[16]。ITGA5在卵巢癌的研究较少，有研究发现卵巢癌患者耐药组中ITGA5的表达明显高于敏感组，且ITGA5的临床表达与肿瘤分级、肿瘤大小均是影响卵巢癌预后的独立危险因素[17]。在非小细胞肺癌中亦发现ITGA5可预测其预后[18]。在乳腺癌[19]、神经胶质瘤[20]等多种肿瘤中亦得到相似结果。本研究在卵巢上皮性癌铂类耐药细胞SKOV3/DDP中检测到ITGA5的高表达，通过siRNA抑制了SKOV3/DDP细胞中ITGA5表达后，SKOV3/DDP细胞侵袭能力明显下降、细胞的生长速度明显减慢。与以上多项研究获得相似的结果，提示ITGA5在卵巢上皮性癌的进展尤其是侵袭、转移过程中起促进作用。

凋亡被认为是肿瘤细胞程序性死亡，是为更好地适应肿瘤微环境而主动采取的一种死亡过程。研究表明恶性肿瘤的发生、发展，与肿瘤细胞无限增殖及细胞凋亡抑制密切相关，许多化疗药物可通过诱导肿瘤细胞凋亡从而实现对肿瘤细胞的杀伤作用。有研究提示ITGA5参与乳腺癌MCF-Dox细胞的凋亡过程，从而参与了对阿霉素的耐药过程[13]。本研究亦发现ITGA5在细胞增殖、顺铂敏感性中都发挥的作用，本研究以实验组细胞的IC50值为基准，设置的三个DDP浓度(1.0 μg/mL、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL)分别对三组细胞作用，发现ITGA5基因下调的SKOV3/DDP细胞可一定程度上增加了对DDP的敏感性，同时在ITGA5基因下调后，DDP作用后卵巢癌SKOV3/DDP细胞凋亡率增多，并且随着DDP剂量增加凋亡率亦升高，存在剂量依赖关系。

综上所述， ITGA5可能是参与卵巢癌SKOV3/DDP耐药细胞增殖、侵袭转移的重要分子，并且在体外水平提示ITGA5参与了卵巢癌SKOV3/DDP凋亡及铂类耐药过程，为研究ITGA5作为晚期卵巢上皮性癌的重要标志物及治疗靶分子提供了一定的理论基础，但其具体的分子作用机制还需进一步实验验证和阐明。

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