人血管紧张素转化酶2(ACE2)BAC 转基因小鼠模型的制备及鉴定

朱孟敏 刘玲玲 牛博文彭秀华陈丽香秦波音杨华李峰*

(1.上海市公共卫生临床中心,上海 201508;2.上海市新发再现传染病研究所,上海 201508)

血管紧张素转化酶2(ACE2)是近年来肆虐全球疫情新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) 的功能宿主受体,由ACE2 功能基因编码翻译的蛋白质属于二肽基羧基二肽酶血管紧张素转化酶家族[1]。人血管紧张素转换酶2(hACE2)基因位于人的X 染色体,编码805 个氨基酸残基,属于Ⅰ型跨膜糖蛋白,相对分子质量为120 × 103。基因编码区较大,长达41 572 bp,目前有关hACE2 基因的表达调控元件研究如火如荼[2-4]。通过基因序列同源性比对,人的血管紧张素转化酶1 与血管紧张素转化酶2 有着较大的相似性[5]。ACE2 在维持体液平衡、血压的稳定、炎症浸润和细胞增殖等方面有着非常重要的作用,同时ACE2 在肾、肠道以及生殖泌尿系统特异性表达意味着其在调节上述器官方面也起到不同的作用[6]。此外,最为重要的是该基因编码蛋白是SARS 病毒糖蛋白的功能受体,该病毒的棘突Spike 蛋白(S 蛋白)可以和人类细胞表面的ACE2 受体特异性结合,造成宿主细胞内感染,从而导致人体内的细胞因子风暴和级联免疫反应[7]。

近几年,hACE2 人源化小鼠模型已成为研究新冠病毒SARS-CoV-2 最具可靠的动物模型,其在新冠疾病入侵途径、病变经过、发病机制和特效药物筛选等热门研究领域扮演着不可或缺的工具载体[8]。目前,hACE2 人源化小鼠模型构建策略主要有3 种形式:(1)通过CRISPR-Cas9 基因编辑技术将鼠源部分序列或者胞外区全部替代为对应的人源序列结构,这样的目的是能够将插入的人源序列发挥最大的作用,并且在不影响小鼠正常生理功能的情况下,使人ACE2 的表达能够充分。(2)在使用人类角蛋白18(cytokeratin 18,K18)启动子作为调控和驱动hACE2 时,将安全岛H11 的位点进行过表达的处理,该手段的主要目标是用于模拟人类易感新冠病毒的感染研究。(3)通过全长替换的方式,将鼠源的ACE2 全长序列替换为对应的人源ACE2序列[9]。以上3 种构建策略在目的基因ACE2 的表达水平上可能有所不同,而且使用不同物种的启动子也会影响上述目的基因的表达。我们的策略是将人的ACE2 功能基因、启动子、增强子和相关的调控序列全部引入到小鼠基因组中,不去除鼠源ACE2 的相关类似的区域,观察在后期基因表达和组织蛋白水平的情况,尤其是研究人源的ACE2 调控序列在小鼠体内发挥的作用。

本文利用长片段BAC 质粒随机整合的方法,将包含有人的ACE2 功能基因、启动子和相关调控序列引入到小鼠基因组中,不仅可以研究人的ACE2 目的功能基因和蛋白在肠道、肾小管和肺血管内皮细胞组织中的表达水平,而且能够比较不同调控序列的长度是否影响功能基因的蛋白表达水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

体重15～18 g 的4 周龄C57BL/6J 雌鼠10 只,体重20～25 g 的12 周龄C57BL/6J 雄鼠10 只,体重25～30 g 的6～8 周龄ICR 雌鼠30 只及体重35～40 g 的3 月龄ICR 雄鼠15 只均为SPF 级动物,购自上海吉辉实验动物饲养有限公司【SCXK(沪)2017-0012】。转基因阳性小鼠为上海市公共卫生临床中心实验动物部【SCXK(沪)2020-0002】保种品系。实验用鼠均饲养于上海市公共卫生临床中心实验动物部【SYXK(沪)2020-0019】SPF 动物设施内。饲养室内光照为12 h 明暗交替,湿度40%～60%,温度22～25℃。动物操作要求符合上海市公共卫生临床中心实验动物伦理要求【公卫伦审2020-D069-01 号】。

1.1.2 主要试剂与仪器

BAC 质粒(BACPAC 资源中心,RP11-478H11),M16 培养液(Merk,M7292-100 ML),M2培养液(Merk,M7176-100 ML),透明质酸酶(Merck,H1136),孕马血清促性腺激素(宁波第二激素厂,PMSG)人绒毛膜促性腺激素(宁波第二激素厂,HCG),动物基因组DNA 小量提取试剂盒(上海莱枫,DK611-02),EasyPure RNA Kit 试剂盒(北京全式金,ER201-01),反转录试剂盒(上海翊圣,11123ES60),qPCR 试剂盒(上海翊圣,11201ES03/08/60),Anti-ACE2 抗体(Abcam,ab108209)。

Leica 组织切片机(Lecia CM1950,德国),显微操作系统(eppendorf,德国),倒置显微镜(Leica,德国),拉针仪(SUTTER,美国),体式显微镜(奥林巴斯,日本),高速冷冻离心机(Thermo,美国),台式摇床(春兰仪器,中国),PCR 仪(eppendorf,德国),生化培养箱(上海一横,中国),qPCR 仪(杭州博日,中国),电泳仪/电泳槽(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BAC 质粒的纯化

商品化BAC 质粒RP11-478H11 (序列号:AC097625.11)全长194 492 bp,包含hACE2 基因及其调控序列。将上述BAC 质粒菌种接种到100 mL氯霉素抗性LB 培养液中,32℃过夜振荡培养16～20 h。用质粒提取试剂盒抽提BAC 质粒,用限制性内切酶切并进行脉冲场凝胶电泳鉴定,脉冲场凝胶电泳参数为电压:6 V/cm、脉冲角度:120℃、转换时间:1～25 s、条带范围:2～300 kb、电泳时间:18 h。将鉴定正确的BAC 质粒在透析液(浓度为0.5 mL的1 mol/L Tris-HCl、10 μL 的0.5 mmol/L EDTA 和1 mL 的5 mol/L NaCl 用无菌水定容到50 mL)中过夜透析纯化,将BAC 质粒溶液稀释到1～3 ng/μL注射备用。

1.2.2 人源化BAC 转基因小鼠获得

利用拉针仪制备注射针(外径:1.0 mm,内径:0.78 mm,长度:10 cm)和固定针(外径:1.5 mm,内径:1.1 mm,长度:10 cm),固定针口为外径100～120 μm,内径20～30 μm 左右,最后弯针角度15°备用。用注射针将稀释的BAC 质粒注射到胚胎的雄原核内,看到原核内部膨大为止,最后转移至M16培养液中培养。于第1 日16:00,将4 周龄C57BL/6J 雌鼠按每只5U 腹腔注射PMSG,饲养47 h 后,按每只5U 腹腔注射HCG 并与种公鼠合笼过夜。第4天9:00 输卵管膨大部收集受精卵进行显微注射。用注射针将稀释的BAC 质粒注射到胚胎的雄原核内,看到原核内部膨大为止,最后转移至M16 培养液中培养。

胚胎移植:取0.5 d 假孕ICR 受体鼠,麻醉,剔除背部毛发,酒精及碘酊消毒,剪开脊柱背侧皮肤,剪开脊柱两侧0.5 cm 处肌肉层,用钝头镊子夹住脂肪垫拉出附带的卵巢及输卵管,用脂肪夹固定,在体视显微镜下找出输卵管壶腹部,用1 mL 注射器针头在壶腹部前侧刺一切口,之后将胚胎经此切口吹入输卵管壶腹部,分别缝合肌肉层及皮肤,碘酊消毒。18 d 后观察代孕鼠的妊娠分娩情况,将出生7 d的小鼠打耳洞标记,并进行hACE2 外源基因整合情况鉴定。

1.2.3 转基因小鼠外源基因的检测

利用表1 中的引物来确定转基因小鼠基因的整合情况。反应体系和条件详见说明书,反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 绝对定量法测定外源基因的拷贝数

使用绝对定量PCR 法对各品系F2 代小鼠的的拷贝数进行检测。按照表1 中的引物进行目的基因的测定,具体的步骤如下:以BAC 质粒为外源基因拷贝数测定的标准样品,将质粒浓度稀释到50 ng/μL,依次10 倍梯度稀释5 次,最终获得5 组标准样品,每个浓度梯度标准品进行3 次重复,来保证有效数据的可靠性。使用表1 中的引物对以上的5 个标准品BAC 质粒进行qRT-PCR 实验。反应体系和条件详见说明书,上述实验每组设置3 个平行的样本。获得的Ct 值通过公式生成的绝对定量标准曲线,从而得到转基因小鼠ACE2 的拷贝数浓度。

1.2.5 相对定量PCR 法检测hACE2、BMX、PIR 和Inc 基因的表达量

收集各品系转基因小鼠的相应组织,进行RNA提取和cDNA 制备,使用qPCR 试剂盒Hieff ®qPCR SYBR® Green Master Mix(No Rox)进行荧光定量PCR。反应体系及仪器操作步骤详见说明书。所获得的Ct 值与对照组进行比较分析。以上qRTPCR 实验中均设置3 个平行样品,并通过3 次重复实验获得结果。

1.2.6 Western Blot 检测hACE2 蛋白表达

将组织剪碎匀浆后,离心取上清,并测定上样蛋白浓度。准备蛋白电泳的试剂物品,按顺序在梳子孔内加入蛋白样品。浓缩胶电压用90 V,分离胶电压用120 V,待溴酚蓝快到底部时停止电泳。之后进行转膜,将PVDF 膜用甲醇透膜,安装转膜装置结构到电泳槽中,电泳仪调至恒流,220 mA,1 h。转膜完成后,取出PVDF 膜,去除多余的膜,标记好正反面。孵育一抗(1 ∶500,4℃过夜)和二抗(1 ∶5000,室温1～2 h),TBST 洗膜3 次,打开化学ECL发光系统,用镊子将膜转移至发光用平板上,滴加ECL 发光液,在化学发光系统中曝光观察,根据条带情况适当调节曝光时间,保存图片。

1.2.7 免疫荧光检测hACE2 蛋白分布

组织的固定及包埋:新鲜组织取材后立刻置于组织固定液中,4℃固定过夜。固定组织PBS 冲洗3遍后,置于30%蔗糖溶液中,4℃冰箱中放置,直至组织块完全沉淀于溶液底部。将组织块取出按正确方向放在包埋盒中,加入OCT,置于液氮蒸汽中速冻,待OCT 完全凝固,放入-80℃冰箱保存待用。

切片及免疫荧光染色:对固定的组织块进行连续切片,每张厚度为10 μm,做好标记,-20℃保存备用。取出切片40℃烘片15 min,PBS 中漂洗3 次,每次10 min;0.3% TritonX-100 中1:10 加入H2O2溶液避光处理15 min;PBS 漂洗3 次,每次10 min;1% BSA+1%马血清室温下封闭2 h;加入一抗ACE2(1 ∶400),4℃放置48 h;去除一抗,PBS 漂洗3 次,每次10 min;加入连有荧光素的相应的二抗,室温避光孵育2 h;PBS 漂洗3 次,每次10 min;DAPI 染色10 min;PBS 漂洗3 次,每次10 min;甘油封片,激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.0 软件进行统计分析。所有数值以平均值± 标准差()的方式显示。用单因素方差分析(ANVOA)进行q检验。组间比较用方差分析,P＜0.05 为差异具有显著性,P＜0.01 为差异极具有显著性。

2 结果

2.1 各品系小鼠整合及拷贝数测定

基因拷贝数检测(图1A)显示,hACE2-15-1 拷贝数最高,而hACE2-14-3 最低。分别在5’UTR、3’UTR、编码区设计鉴定引物(图1B),将获得的F0 代小鼠基因组进行PCR 鉴定,共获得4 只阳性首建鼠,分别与C57BL/6J 小鼠进行杂交育种获得4 个品系,除hACE2-ident30KB-3UTR 在hACE2-14-3 品系未能扩增出目的条带,其他引物均能在4 个hACE2 转基因小鼠基因组中扩增出单一明亮的条带(图1C),基因整合情况如图1B所示。

图1 外源基因检测、拷贝数鉴定及在整合片段在BAC 上的位置Note.A.Four transgenic mice copy number histogram of foreign gene hACE2.B.PCR map of genome identification of four transgenic mice.C.The position of four transgenic mouse integration fragments on BAC.Figure 1 Foreign gene detection,copy number identification and position of integrated fragment on BAC

2.2 相对荧光定量PCR 法检测小鼠肠道四段中hACE2 基因表达水平

相对荧光定量PCR 结果显示,十二指肠、空肠、回肠和结肠中,hACE-14-3 小鼠品系hACE2 mRNA表达最高,hACE2-6-9 最低,其余两个品系差异不大(图2)。hACE2-6-9 和hACE-14-3 品系在肠道四段中人的ACE2 的mRNA 的相对表达量差异极具显著性(P＜0.01)。hACE-14-3 与hACE2-15-1 在十二指肠和回肠中,mRNA 的相对表达量差异具有显著性(P＜0.05),空肠和结肠中,在mRNA 的相对表达量差异极具显著性(P＜0.01)。hACE-14-3 与hACE2-15-2 在十二指肠中,mRNA 的相对表达量差异具有显著性(P＜0.05),而在回肠中,无显著性差异,在空肠和结肠中,mRNA 的相对表达量差异极具显著性(P＜0.01)。

图2 十二指肠、空肠、回肠和结肠中hACE2 的mRNA 相对表达水平Note.A.mRNA expression in duodenum of four transgenic mice.B.MRNA expression of four transgenic mice in jejunum.C.MRNA expression in ileum of four transgenic mice.D.MRNA expression of four transgenic mice in colon.Compared with hACE2-14-3,*P ＜0.05,**P ＜0.01.Figure 2 Relative expression levels of hACE2 mRNA in duodenum,jejunum,ileum and colon

2.3 Western Blot 检测小鼠肠道四段hACE2 蛋白的表达

在转基因hACE2 小鼠的肠道四段组织中,hACE2-14-3 的hACE2 蛋白表达水平最高,hACE2-15-1 次之,其他2 个小鼠品系未检测相关蛋白的表达(图3)。其中,在十二指肠组织中,hACE2-14-3 有微量的hACE2 蛋白表达,其他品系在小鼠中未检测到相关蛋白的表达(图3A)。在空肠组织中,hACE2-14-3 的蛋白表达水平最高,其他品系在小鼠中未检测到相关蛋白的表达(图3B)。在回肠组织中,hACE2-14-3 的蛋白表达水平依然最高,hACE2-15-1 次之,其他品系在小鼠中未检测到相关蛋白表达(图3C)。在结肠组织中,hACE2-14-3 的hACE2 蛋白表达水平最高,其他品系基本无表达(图3D)。

图3 十二指肠、空肠、回肠和结肠中hACE2 蛋白的相对表达水平Note.A.Expression of hACE2 protein in duodenum of four transgenic mice.B.Expression of ACE2 protein in jejunum of four transgenic mice.C.Expression of ACE2 protein in ileum of four transgenic mice.D.Expression of ACE2 protein in colon of four transgenic mice.Figure 3 Relative expression levels of hACE2 protein in duodenum,jejunum,ileum and colon

2.4 相对定量PCR 法测定小鼠空肠和结肠中hACE2 基因座其他3 个基因的表达水平

图4A 是在4 个品系小鼠空肠和结肠组织的BMX 基因mRNA 的表达水平,其中hACE2-15-1的BMX 基因在空肠中mRNA 表达水最高,hACE2-6-9 表达最低,结肠组织中,hACE2-15-2的表达最高,hACE2-6-9 的表达依然最低。图4B是在4 个品系小鼠空肠和结肠组织的PIR 基因mRNA 的表达水平,其中hACE2-15-2 的PIR 基因在空肠中mRNA 表达水最高,而hACE2-15-1表达最低,在结肠组织中,hACE2-6-9 的表达最高,hACE2-15-1 的表达最低。图4C 是在4 个品系小鼠空肠和结肠组织的Inc 基因mRNA 的表达水平,其中hACE2-15-2 的Inc 基因在空肠中mRNA 表达水最高,hACE2-6-9 表达最低,在结肠组织中,hACE2-15-2 的表达最高,hACE2-15-1 的表达最低。

图4 空肠和结肠中3 种mRNA 剪切形式基因的表达水平Note.A.Expression level of BMX gene mRNA in jejunum and colon of four transgenic mice.B.Expression level of PIR gene mRNA in jejunum and colon of four transgenic mice.C.Expression level of Inc gene mRNA in jejunum and colon of four transgenic mice.Figure 4 Gene expression levels of three mRNA cleavage forms in jejunum and colon

2.5 免疫荧光检测肾小管和肺血管内皮细胞中hACE2 的分布

免疫荧光染色结果显示,以对照组hACE2-15-1肾小管未加抗体为参照,可见实验组hACE2-15-1 肾小管中有较为丰富的的hACE2 的蛋白表达(图5a,5b,5c,5d,5e,5f)。在实验组肺血管内皮细胞中,如红色箭头所示,hACE2 均匀的表达分布在血管内皮细胞中(图5g,5h,5i),对照组小鼠品系在肺血管内皮细胞中hACE2 则无表达(图5j,5k,5l)。

图5 hACE2-15-1 肾小管和肺血管内皮细胞中hACE2 的免疫荧光Figure 5 hACE2-15-1 immunofluorescence of ACE2 in vascular endothelial cells of renal tubules and lungs

3 讨论

SARS-CoV-2 感染小鼠模型是有效解决新冠病毒入侵人体后,病毒的复制增殖、致病机制机理和疫苗药物研发的重要研究工具和手段[10]。ACE2 人源化转基因小鼠可能作为有价值的SARS-CoV、SARS-CoV-2 易感动物模型。目前已报道多种ACE2人源化转基因小鼠。研究结果显示这些hACE2 人源化转基因小鼠存在诸多缺陷[11]。CAG 复合启动子全身性普遍表达hACE2 基因,CK18 启动子在上皮细胞表达hACE2 基因,这两种转基因小鼠不能模拟hACE2 基因的真实表达情况[12]。小鼠Ace2 启动子由于不能含有全部的小鼠Ace2 基因调控区而只能部分模拟鼠源性hACE2 基因的表达[13]。Donoghue 等[14]制作在心脏特异性表达hACE2 的人源化转基因小鼠,ACE2 超表达引起心脏传导异常及室性心律失常。感染实验显示hACE2 转基因表达水平和病毒感染后病理变化程度直接相关,即hACE2 转基因表达水平严重影响SARS-CoV 病毒复制水平及感染后组织病理变化。接近生理性表达水平的hACE2 人源化转基因小鼠预期更有利于心血管疾病以及新冠肺炎(COVID-19)发病分子机制研究和相关药物研发[15]。我们利用含有194 kb 的hACE2 基因座位点的细菌人工染色体(BAC),结合小鼠原核显微注射技术,成功制备4 个含有全长hACE2 基因序列的人源化BAC 转基因小鼠品系。人源化小鼠含有完整的hACE2 基因调控序列,包括hACE2 5’-UTR、3’-UTR 以及全部的内含子区和外显子区。这些人源化小鼠均携带包括rs2074192、rs6632677、rs4646142、rs4240157、rs2048683 在内的人ACE2 的5 个SNP 突变位点,保留完整的人hACE2 启动子及基因调控区,从而为心血管疾病、新冠肺炎发病机制研究、hACE2 基因表达调控机制研究和药物、疫苗的研发提供重要工具。

人ACE2 基因表达调控比较复杂,受诸多因素影响。高血压和糖尿病小鼠肾内,ACE2 的蛋白表达下调。Zisman 等[16]发现,在人特发性扩张型心肌病的终末期心脏中,ACE2 的表达明显增加。Kuba等[17]发现,在急性肺损伤小鼠动物模型中,ACE2 表达明显减少。Koitka 等[18]发现,ACE2 在肾病和肾次全切除大鼠体内的表达明显减少。RAAS 抑制剂,包括血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ型受体拮抗剂可以上调ACE2 mRNA 水平[19]。近期研究表明ACE2 可能参与了SARS-CoV-2 感染人体诱发多脏器损伤过程,其可能的机制是SARSCoV-2 结合ACE2 后,通过不明机制下调人体细胞中ACE2 含量,失调ACE-Ang II-AT1R 轴和ACE2-Ang 1-7-Mas 轴之间的平衡,Ang 1-7 水平下降,而Ang II 表达绝对或是相对升高,使细胞因子(尤其促炎因子)表达升高,诱发炎症风暴,出现全身炎症反应[20]。本研究制备的几个小鼠品系,我们对肠道中ACE2 的表达进行较深入的研究,hACE2-14-3 小鼠品系整合最短的3’UTR 区域,检测肠道四段的mRNA 水平和蛋白表达量发现,与其他未丢失3’UTR 区域的小鼠品系相比ACE2 表达产物要高,表明3’UTR 基因组区域可能存在肠道特异性表达的调控序列。

目前研究发现,自然SARS-Cov-2 仅可感染树鼩、雪貂、非人灵长类等动物,对小鼠无法感染,故ACE2 转基因人源化小鼠普遍被应用于SARS-Cov-2等临床研究。常见的ACE2 转基因鼠有多种,包括以小鼠ACE2 启动子、CMV、HFH4、或K18 启动子驱动人ACE2 cDNA 表达的转基因鼠,以及小鼠ACE2部分片段人源化的基因敲入小鼠,这些小鼠模型在感染SARS-Cov-2 病毒以后均出现不同程度的临床症状,但与人临床症状还有一定的差异,这可能与转基因小鼠中hACE2 的表达调控与人存在差异有关。本研究制备的BAC 转基因人源化小鼠含有较完整的ACE2 启动子区域及增强子区,相比于传统的转基因鼠或者基因敲入小鼠,能够更好地在小鼠体内模拟人ACE2 的表达调控。且本研究制备的小鼠在肾小管上皮细胞、肺血管内皮细胞和肠道等组织中均有人ACE2 的表达,与人体中ACE2 的定位相近,是ACE2 基因表达调控、心血管疾病和冠状病毒感染机制等研究的良好小鼠模型,也为新冠药物疫苗开发提供一些数据参考。

总之,本研究报道了1 种全长基因序列的hACE2 人源化BAC 转基因小鼠。该小鼠有以下特点:(1)含有全长hACE2 基因序列,包括全部的内含子区;(2)含有人源hACE2 基因自身的启动子,且包含hACE2 基因5’-UTR 和3’-UTR 基因表达调控区;(3)携带包括rs2074192、rs6632677、rs4646142、rs4240157、rs2048683 在内的人ACE2 的5 个SNP突变位点,这5 个SNP 突变位点可能和病毒感染及人群疫苗接种后免疫反应有关联。