莲心碱通过抑制NF-κB 激活Nrf2/HO-1 通路发挥抗炎抗氧化作用

张锐虎 姚茹 史泽雅郭民霍怡彤侯佳楠陈朝阳*

(1.山西医科大学实验动物中心,太原 030001;2.山西省实验动物与人类疾病动物模型重点实验室,太原 030001)

氧化应激与炎症是造成许多疾病发生的重要原因,如急性肺损伤等[1]。因此,寻找同时具有抗炎与抗氧化作用的药物将对此类疾病的治疗具有积极作用。RAW264.7 细胞是小鼠巨噬细胞,巨噬细胞在一些炎性组织损伤中起关键作用,是一种主要的免疫效应细胞[2]。LPS 是革兰氏阴性菌外膜的主要成分,会通过抑制Nrf2/HO-1 通路与激活NFκB、MAPK 通路刺激巨噬细胞ROS 含量的增加和炎症介质的生成[3]。近年来,许多传统药物的活性成分被提取用于疾病的研究[4],其中莲心碱是一种二苄基四氢异喹啉类生物碱,从莲子中分离得到,具有抗高血压、抗心律失常、血管平滑肌等生物活性[5]。已报道莲心碱对叔丁基过氧化氢诱导的人肝细胞HepG2 细胞系氧化应激具有细胞保护作用[6],还可抑制大鼠灌注后炎性因子TNF-α 和IL-1的表达[7],但并未报道其抗氧化抗炎作用靶点,前期我们也在动物水平证明了莲心碱通过抗氧化与抗炎作用对急性肺损伤具有显著预防效果[8]。因此,本研究我们将在细胞水平对莲心碱抗炎抗氧化作用及分子机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

RAW264.7 细胞购于上海细胞库。

1.1.2 主要试剂与仪器

莲心碱(HPLC ≥98%)(北京中科质检生物有限公司,批号:2586-96-1,中国);脂多糖(Sigma 公司,美国);TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司,中国);CCK-8、NO、PGE2试剂盒(碧云天生物技术有限公司);ROS、GSH、MDA、SOD 试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国);PrimeScriptTMRTMasterMix、SYBR PremixEX TaqⅡ(TaKaRa 公司,日本);一抗、二抗(CST 公司,美国);β-actin、COX-2、iNOS 引物由上海生工合成;化学发光成像仪(G-Box Chemixx9,Syngene 公司,英国);流式细胞仪(FACS-Calibur,BD 公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

RAW264.7 细胞用完全培养基培养(89%的DMEM 培养基、10%胎牛血清和1%的100 IU/mL 青霉素-链霉素)培养在培养箱中(37℃和5% CO2)。

1.2.2 CCK-8 毒性检测

将RAW264.7 细胞接种到96 孔板(5 × 104个细胞/孔)中,培养24 h 后,加入100 μL 不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、4、8 和16 μmol/L)的莲心碱。24 h后,倒掉培养基,每孔加入10 μL 的CCK-8 和100 μL 含莲心碱的培养液,孵育4 h 后在酶标仪450 nm 下检测吸光度。

1.2.3 细胞炎症相关指标的测定

RAW264.7 细胞被接种到24 孔板(1 × 105个细胞/孔)中,培养24 h 后,加入100 μL 不同浓度的莲心碱(0.5、1、2 μmol/L)2 h,用LPS(2 μg/mL)刺激24 h。将细胞培养液离心(2000 rpm,10 min)后吸取上清至新的离心管,在各孔细胞中均加入50 μL Griess Reagent Ⅰ、Griess Reagent Ⅱ后轻轻振荡,于540 nm 下检测,以测定NO 浓度。按ELISA 试剂盒说明书检测上清液中PGE2、TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量。

1.2.4 qRT-PCR

RAW264.7 细胞被接种在6 孔板(2 × 105个细胞/孔),培养24 h,随后用不同浓度的莲心碱(0.5、1、2 μmol/L)处理细胞2 h,用2 μg/mL LPS 刺激细胞12 h。采用TRIzol 试剂裂解细胞提取总RNA 后进行浓度测定,反转录为cDNA,进行qRT-PCR 检测,结果以2-ΔΔct相对表达量表示。引物为:COX-2:F:5′-CTGGAACATGGACTCACTCAGTTTG-3′,R:5′-AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3′;iNOS:F:5′-CAAGC ACATTTGGGAATGGAGA-3′,R:5′-CAGAACTGAGGG TACATGCTGGAG-3′;β-actin:F:5′-CAAGCACATT TGGGAATGGAGA-3′,R:5′-CAGAACTGAGGGTACAT GCTGGAG-3′。

1.2.5 细胞氧化应激相关指标的测定

RAW264.7 细胞被接种在6 孔板(2 × 105个细胞/孔),培养24 h,随后用不同浓度的莲心碱(0.5、1、2 μmol/L)处理细胞2 h,用2 μg/mL LPS 刺激细胞1 h。孵育30 min(10 μmol/L DCFH-DA,37℃),收集细胞悬液离心(1000 r/min,10 min),倒掉上清加200 μL Binding Buffer 用流式进行检测,结果以平均荧光强度值表示,代表ROS 含量。

RAW264.7 细胞被接种到6 孔板(2 × 106个细胞/孔),培养24 h 后,加入100 μL 不同浓度的莲心碱(0.5、1、2 μmol/L)2 h,用2 μg/mL LPS 刺激12 h,倒掉上清,收集细胞后根据相应试剂盒说明书测定MDA、SOD 和GSH 的含量。

1.2.6 Western Blot

将3 × 106细胞接种于T25 细胞培养瓶,培养12 h,随后用0.5、1、2 μmol/L 的莲心碱干预细胞6 h,2 μg/mL LPS 诱导细胞1 h。PBS 清洗两次细胞,加入1 mL 裂解液冰上裂解30 min,吸至离心管中离心(12 000 rpm,10 min,4℃),吸取上清测蛋白浓度,加入Loading Buffer 后煮沸5 min。进行凝胶电泳,转膜,封闭,一抗孵育过夜,二抗孵育,曝光,用Image J 进行条带分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 进行统计学分析,结果以平均值± 标准差()表示,两组比较采用LSD-t检验,P＜0.05 与P＜0.01 被认为差异具有显著性以及差异极具显著性。

2 结果

2.1 莲心碱对LPS 刺激的RAW264.7 细胞具有抗炎作用

当用0～4 μmol/L 莲心碱处理时,细胞存活率没有降低,我们在随后的实验中使用了无毒浓度(0.5、1 和2 μmol/L)莲心碱。

如图1 所示,与对照组相比,LPS 组NO(表示为亚硝酸盐)、PGE2 和促炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1)的含量显著增加(P＜0.01),与LPS 组相比,莲心碱组显著抑制了这些促炎介质的生成(P＜0.01),且与莲心碱剂量呈依赖性。

图1 莲心碱对LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞的NO、PGE2、TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影响Note.Compared with the control group,#P ＜0.05,##P ＜0.01.Compared with the LPS group,*P ＜0.05,**P＜0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Effects of LIE on the concents of NO,PGE2,TNF-α,IL-6 and IL-1β in LPS-induced RAW264.7 Macrophages

2.2 莲心碱抑制了LPS 诱导的RAW264.7 细胞中 COX-2、iNOS mRNA 表达和NF-κB、MAPK通路

qRT-PCR 结果如图2A,2B 所示,与对照组相比,LPS 组COX-2 与iNOS mRNA 表达量显著升高(P＜0.01),莲心碱处理后,与LPS 组相比,显著降低了COX-2 与iNOS 的mRNA 表达量(P＜0.01)。

Western Blot 检测结果如图2C,2D,2E,2F 所示,与对照组相比,LPS 组IκBα 显著发生降解和磷酸化,NF-κB p65、p38、ERK1/2、JNK1/2 显著发生磷酸化(P＜0.05);与LPS 组相比,莲心碱组显著抑制了IκBα 的降解和磷酸化以及NF-κB p65、p38、ERK1/2 和JNK1/2 的磷酸化(P＜0.05),这些结果表明莲心碱可以抑制NF-κB 和MAPK 通路。

图2 莲心碱对LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞的COX-2 和iNOS 的表达以及NF-κB 和MAPKs 通路的影响Figure 2 Effects of LIE on iNOS mRNA expression and NF-κB and MAPKs pathway in LPS -induced RAW264.7 Macrophages

2.3 莲心碱对LPS 诱导的RAW264.7 细胞的抗氧化作用

如图3 所示,通过对平均荧光值分析表明,与对照组相比,LPS 组的ROS 生成增加,但使用莲心碱进行处理后,ROS 生成显著减少(P＜0.01),LPS组MDA 含量显著增加,GSH 含量和SOD 活性显著降低(P＜0.01),莲心碱进行处理后,MDA 含量显著减少,SOD 活性和GSH 含量显著增加(P＜0.01)。

2.4 莲心碱激活了LPS 诱导的RAW264.7 细胞中Nrf2/HO-1 通路

如图4 所示,与LPS 组相比,莲心碱组Keap1表达显著降低,并以剂量依赖的方式促进Nrf2 和HO-1 表达(P＜0.05)。这些结果表明,莲心碱有效地激活了Nrf2/HO-1 通路。

图4 莲心碱对LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞中Nrf2/HO-1 通路的影响Figure 4 Effects of LIE on Nrf2/HO-1 pathway in LPS-induced RAW364.7 macrophages

3 讨论

炎症与氧化应激是互相依赖存在的[9],许多疾病同时伴随着炎症与氧化应激的发生,如急性肺损伤,莲心碱已被证实具有抗炎抗氧化作用[8],但分子机制尚未明确,因此明确其抗炎抗氧化机制对于此类疾病的治疗具有重要意义。我们通过LPS 诱导RAW264.7 细胞不仅验证了莲心碱的抗炎抗氧化作用而且证明了其抗炎抗氧化作用的机制。

PGE2 和NO 是两种重要的促炎介质[10];iNOS向体内传递气体信号并参与NO 的产生;环氧合酶COX-2 参与PGE2 的产生[11]。我们的研究表明,莲心碱通过降低COX-2 和iNOS 的转录水平,显著降低了PGE2 和NO 的生成。TNF-α、IL-1β 和IL-6 作为促炎因子可以促进炎症[12]。我们的研究结果表明,莲心碱能显著降低TNF-α、IL-1β 和IL-6 的释放,从而证实了莲心碱的抗炎活性。LPS 通过促进IκBα 的降解,将重要的抗炎分子靶标NF-κB 从IκBα 中分离出来。许多炎症介质,包括诱导型iNOS 和COX-2,将随着NF-κB 进入细胞核而增加表达[13-14]。当LPS 诱导炎症时,MAPK 信号通路被激活,P38、ERK 和JNK 被磷酸化,还调节某些基因的转录水平,包括iNOS 和COX-2[15-16]。在我们的研究中,莲心碱阻断了IκBα 的降解,并抑制了p65、p38、ERK 和JNK 的磷酸化。因此,莲心碱的抗炎作用可能是通过抑制NF-κB 和MAPK 通路来实现的。

当机体发生氧化应激会产生过量的ROS,破坏抗氧化系统,致使细胞发生氧化性损伤[17]。MDA可以破坏细胞膜,这是氧化应激的标志,氧化应激造成的损害可以通过抗氧化酶的活性得到改善,包括SOD 和GSH[18-19]。实验表明,莲心碱能显著降低LPS 诱导的ROS 和MDA 的生成。此外,LPS 诱导巨噬细胞会降低GSH 水平和SOD 活性,莲心碱可以有效地逆转这一改变。许多天然植物化合物可以通过Nrf2/HO-1 途径减轻LPS 诱导的氧化应激。当抗氧化分子进入细胞时,Nrf2 从Keap1 分离并移位到细胞核,上调HO-1 的表达,从而发挥抗氧化作用[20]。我们的研究表明,用莲心碱处理后显著增加了Nrf2 和HO-1 的核表达,降低了Keap1 的表达。在此,我们证明了莲心碱可能通过激活Nrf2/HO-1 通路来减轻LPS 引起的氧化应激。

综上所述,莲心碱通过抑制NF-κB 和MAPK 信号通路,从而抑制iNOS 和COX-2 的表达和促炎因子(TNF-α、IL-1β 和IL-6)的释放,发挥抗炎作用;通过活化Nrf2/HO-1 通路,抑制ROS、MDA 的生成,增加SOD 的活性和GSH 的含量,发挥抗氧化作用。本研究对莲心碱抗炎抗氧化作用机制的研究期望可以为伴有炎症与氧化应激的疾病的治疗提供一个新的方向。