精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列修饰对流感病毒溶瘤能力的影响

杨英，龙琼，杨颖，2，李多，3，杨姝，马雁冰

1.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南昆明 650000；2.昆明医科大学，云南 昆明 650000；3.云南省疾病预防控制中心，云南 昆明 650000

近年，免疫疗法成为肿瘤治疗中的研究热点，但在实体瘤内形成免疫细胞无法到达的“免疫荒漠”使免疫疗法对实体瘤的治疗效果不佳［1］。溶瘤病毒是一种经基因工程法制备而成或天然存在的病毒，可在不伤害正常组织的情况下选择性地在癌细胞中复制并杀死癌细胞［2］，具有良好的靶向性、肿瘤杀伤能力和调节免疫的功能［3］。流感病毒属于正黏病毒科，含有8 个单负链RNA 片段的包膜病毒，8 个片段分别编码碱性聚合酶2（polymerase basic 2，PB2）、碱性聚合酶1（polymerase basic 1，PB1）、酸性聚合酶（polymerase acidic，PA）、血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nucleoprotein，NP）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）、基质蛋白（matrix protein，M）和非结构蛋白（nonstructural protein，NS）［4］，RNA 与NP 结合形成核糖核蛋白体（ribonucleoprotein，RNP），病毒包膜表面含有刺突HA 和NA［5］。近年研究显示，流感病毒具有较强的免疫调控能力，其基因不会整合至宿主基因组及引起慢性疾病，该病毒的减毒形式具有针对肿瘤细胞的裂解活性，可能引起肿瘤细胞免疫原性死亡（immunognic cell death，ICD）［6-10］。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列是整合素最小的受体结合序列，是目前设计用来识别αvβ3的基序［11］。αvβ3 是影响肿瘤生长、肿瘤侵袭、转移、血管生成、炎症最突出的受体［12-14］，在上皮细胞和成熟内皮细胞上的表达水平相对较低，但在肿瘤新生血管和一些肿瘤细胞中表达水平较高，因此，RGD 序列具有介导肿瘤组织特异靶向的潜力［15］。HA 是流感病毒表面用于识别并吸附靶细胞的刺突蛋白［16］，本研究将具有靶向肿瘤组织的RGD-4C（CDCRGDCFC）构建至流感病毒的HA 上，并检测RGD 修饰对流感病毒溶瘤作用的影响。

1 材料与方法

1.1 质粒及细胞 分别含PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和NS 的质粒PHW200（八质粒）由圣裘德儿童研究医院病毒学和分子生物学系Robert G.Webster 教授惠赠；经RGD 修饰（HA-RGD）的八质粒［PHW2000-HA 质粒中HA 的信号肽（signal peptides，SP）序列后插入RGD 序列，并在两端插入NedⅠ和BamHⅠ酶切位点，为减小RGD 的空间位阻，在RGD 序列后添加了GSGG 柔性臂］由中国医学科学院医学生物学研究所分子免疫实验室构建，人肾上皮细胞（293T）、小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10）、非小细胞肺癌细胞（A549）、宫颈癌细胞（TC-1）、小鼠结直肠癌细胞（CT26）、小鼠乳腺癌细胞（4T1）和Vero 细胞由该实验室保存；MDCK 细胞由云南省疾病与控制中心保存。

1.2 主要试剂 RPMI1640 和DMEM-F12 培养基购自以色列Biological Industrial 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和Opti-MEM 购自美国Gibco 公司；转染试剂Lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen 公司；病毒RNA 抽提试剂盒购自美国OMEGA 公司；逆转录试剂盒购自南京诺维赞生物科技股份有限公司；结晶紫购自北京索莱宝科技有限公司；CCK8 试剂盒购自美国Proteintech 公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒购自中国碧云天生物技术公司；甲型流感病毒（尿囊液）快速检测试纸条购自美国NBGene 公司。

1.3 实验动物 SPF 级C57BL／6 小鼠，雌性，6 ～ 8周龄，体重16 ～ 18 g，由中国医学科学院医学生物学研究所（IMBCAMS）小动物实验中心提供，SPF条件下饲养，动物许可证号为：SYXK 滇2019-0003。所有动物实验均经中国医学科学院医学生物学研究所实验动物使用和管理委员会批准（批准文号为：DWSP201905008）。9 ～ 10 日鸡胚购自云南普吉禽业有限公司。

1.4 细胞培养 用含10% FBS、100 U／mL 青霉素和0.1 mg／L 链霉素的RPMI1640 培养基培养B16-F10、A549、TC-1、CT26、4T1 和Vero 细胞，于37 ℃培养至细胞融合度为60%，用于后续试验；用含10%FBS、100 U／mL 青霉素和0.1 mg／L 链霉素的DMEM-F12培养基培养293T 和MDCK 细胞，于37 ℃培养至细胞融合度为80%时，用于后续试验。

1.5 流感病毒的拯救 将293T 细胞按5×105个／孔接种至6 孔板，37 ℃培养过夜，细胞融合度达60% ～70%，更换为含10% FBS 的DMEM-F12 培养基，继续培养1 h。分别取八质粒及RGD 修饰的八质粒各500 ng，用Opti-MEM 补充至150 μL，室温孵育5 min；将Lipofectamine 2000 与含八质粒及含RGD 修饰的八质粒的Opti-MEM 按1 ∶19 的体积比混匀，室温孵育20 min［17］。将混合液滴加至6 孔板，300 μL／孔，置37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h；补加1 mL 无抗培养基培养基，继续培养72 h；将培养物冻融至少1次，于4 ℃，800 × g 离心5 min，收集上清液，用于病毒扩增。八质粒及RGD 修饰的八质粒拯救的病毒分别为野生型流感病毒和重组RGD 流感病毒。

1.6 流感病毒的扩增 于鸡胚的鸡头正上方气室边缘约2 mm 处标记，无菌条件下在标记处打孔，经小孔接种200 μL 拯救的病毒上清液［18］，石蜡封孔，置34 ℃，60%湿度的培养箱中孵育72 h，再置4 ℃过夜；无菌取尿囊液，经10000 × g 离心20 min，收集上清。取300 μL，置1.5 mL EP 管中，用甲型流感病毒（尿囊液）快速检测试纸条进行检测，并参考文献［19］，采用血凝试验检测重组流感病毒及野生型流感病毒的血凝效价。

1.7 病毒传代稳定性的检测 以距RGD 上游17 bp的一段序列及其下游160 bp 处的序列分别作为上下游引物，上游引物：5′-GGCAAAACTACTGGTCCTGTTATATGCAT-3′，下游引物：5′-CCAAGAGCCATCCGGTGATGTTACATT-3′，野生型及重组RGD 流感病毒扩增产物的大小分别为233 和284 bp。引物由擎科生物技术有限公司合成。将获得的野生型和重组RGD 流感病毒均扩增3 代（P2、P3、P4），用病毒RNA抽提试剂盒提取病毒RNA，以其为模板进行PCR 扩增。PCR 反应条件为：95 ℃变性5 min，58 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共30 个循环。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.8 病毒大小的检测 取野生型和重组RGD 流感病毒液，经0.45 μm 滤器过滤，于4 ℃，40000 × g 离心2 h；用PBS 重悬，于显微镜下测量病毒大小。

1.9 病毒滴度的检测 将MDCK 细胞按1×106个／孔接种至6 孔板，37 ℃培养过夜；细胞融合度达80% ～90%时，无菌PBS 洗涤2 ～ 3 次；用含0.8% TPCK胰酶的无血清DMEM-F12 稀释野生型及重组RGD 流感病毒，稀释梯度为10-2～ 10-7，加入6 孔板，500 μL／孔，补加500 μL 含0.8%TPCK 胰酶的无血清DMEM-F12 培养基，于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育1 h；用PBS 洗涤2～3 次，将1.6%的琼脂按1 ∶1 的比例加入含1.6%TPCK 胰酶的无血清DMEM-F12 培养基，混匀，加入6 孔板，2 ～ 3 mL／孔［20］，琼脂糖凝固后继续培养72 h；加入4%多聚甲醛，2 mL／孔，固定8 h；1%结晶紫溶液染色20 min，镜下观察噬斑。选择噬斑数在3～30 之间的孔，按下式计算病毒滴度。

1.10 流感病毒对不同细胞亲嗜性的检测 将B16-F10、A549、TC-1、CT26、4T1 和Vero 细胞按5 × 103个／ 孔接种至96 孔板，每种细胞设6 个重复，于37 ℃培养过夜；用无血清培养基稀释病毒，使MOI 为0.1和0.01，加入96 孔板，100 μL／孔，同时设空白对照（仅加培养基）和阴性对照（仅含细胞不加病毒），37 ℃，5% CO2培养箱中孵育1 h；去病毒液，加入无血清培养基，200 μL／孔，继续培养，分别于培养24、48 和72 h 时，加入CCK8 检测液，10 μL／孔，避光孵育2 h；倒置荧光显微镜下观察孔内细胞形态后，用酶标仪检测A450和A620，并按下式计算细胞活力。

1.11 不同细胞中LDH 释放率的检测 将B16-F10、A549、TC-1、CT26、4T1 和Vero 细胞按1 × 104个／ 孔接种至48 孔板，处理方式同1.10 项，但每孔加入的培养基和病毒稀释液的量提高1 倍，同时设空白对照孔（仅有培养基）和细胞最大酶活性对照孔（含细胞不加病毒），培养71 h；细胞最大酶活性对照孔加入10% LDH 释放剂，继续培养1 h；取上清，500 × g 离心5 min，取120 μL 上清，加入96孔板，每个样品设2 个复孔，用LDH 检测试剂盒进行检测，酶标仪检测A490，并按下式计算LDH 释放率。

1.12 流感病毒对小鼠体内黑色素瘤肿瘤作用的检测将B16-F10 细胞用PBS 调节至浓度为2×106个／mL，与等量基质胶混匀。将小鼠经腹部皮下接种混悬液，100 μL／只。接种后7 d，接种部位可触摸到直径约2 mm 的肿瘤，将荷瘤小鼠随机分为3 组：野生型流感病毒组、重组RGD 流感病毒组、PBS 对照组。每隔1 d 经瘤内注射给药1 次，100 μL／只，共注射5 次。于肿瘤细胞接种19 d 后，测量肿瘤大小；接种25 d 后，计算小鼠存活率。

1.13 统计学分析 应用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行统计学分析，样本数据采用非配对／ 配对双尾t 检验或Two way ANOVA 检验分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒的鉴定 重组RGD 流感病毒经胶体金法试纸条鉴定为阳性，与野生型流感病毒一致，见图1。表明病毒液中存在流感病毒。

图1 野生型（A）及重组RGD 流感病毒（B）胶体金法试纸条鉴定Fig.1 Colloidal gold strip test of wild（A）and recombinant RGD influenza virus（B）

2.2 病毒效价 野生型及重组RGD 流感病毒的血凝效价分别为1 ∶28和1 ∶29，二者之间差异较小，见图2。表明RGD 的插入并未影响流感病毒的效价。

图2 血凝试验结果Fig.2 Result of HA test

2.3 流感病毒的传代稳定性 野生型和重组RGD流感病毒经1%琼脂糖凝胶电泳分析，分别于233 和284 bp 处可见目的条带，见图3。表明外源基因已成功插入，且传代稳定性良好。

图3 PCR 法鉴定流感病毒的传代稳定性Fig.3 Identification of stability in subculture of influenza virus by PCR

2.4 病毒大小 野生型及重组RGD 流感病毒的直径均在80 ～ 120 nm 范围内，见图4。表明外源基因RGD 的引入并未改变病毒的大小。

图4 镜下观察野生型（A）及重组RGD 流感病毒（B）的大小Fig.4 Microscopy of wild（A）and recombinant RGD influenza virus（B）

2.5 病毒滴度 野生型及重组RGD 流感病毒滴度分别为3×107和1.8×107PFU／mL，表明重组RGD流感病毒与野生型流感病毒在拯救过程中未发生改变。

2.6 流感病毒对不同细胞的亲嗜性 B16-F10、A549、TC-1、CT26、4T1 及Vero 细胞阴性对照的细胞活力均为100%。野生型和重组RGD 流感病毒感染B16-F10和A549 细胞48 和72 h 后细胞活力大幅降低，其他细胞在感染病毒后细胞活力变化较小，见表1。B16-F10和A549 细胞在感染流感病毒后发生典型细胞病变（cytopathic effect，CPE），即细胞变圆、肿胀、脱落，其他细胞未见明显CPE，见图5。表明流感病毒对B16-F10和A549 细胞具有较好亲嗜性，RGD 的引入并未改变流感病毒对肿瘤细胞的亲嗜性。

图5 野生型（A）及重组RGD 流感病毒（B）对各种细胞形态的影响（× 20000）Fig.5 Effect of wild（A）and recombinant RGD influenza virus（B）on morphologies of various cells（× 20000）

表1 流感病毒对各种细胞活力的影响（%）Tab.1 Effect of influenza virus on viabilities of various cells（%）

2.7 肿瘤细胞中LDH 的释放率 MOI 为0.01 和0.1 时，与相应野生型流感病毒组比较，重组RGD流感病毒组B16-F10 细胞中LDH 释放率明显升高（t 分别为44.18 和22.93，P 分别<0.001 和<0.05）；A549 细胞中LDH 释放率略升高，但差异无统计学意义（t 分别为1.269 和0.323，P > 0.05）。其他细胞中LDH 释放率均较低。见图6。表明RGD 的引入使流感病毒对B16-F10 细胞的杀伤力增强。

图6 各种细胞中LDH 的释放率Fig.6 LDH release rates in various cells

2.8 流感病毒对小鼠体内黑色素瘤肿瘤的作用 肿瘤细胞接种19 d 后，野生型流感病毒组及重组RGD流感病毒组小鼠肿瘤大小明显小于PBS 组（t 分别为7.774 和5.437，P < 0.001），见图7。肿瘤细胞接种25 d 后，PBS 组、野生型流感病毒组、重组RGD 流感病毒组小鼠存活率分别为50%、80%、80%，野生型流感病毒组和重组RGD 流感病毒组明显高于PBS 组（t 均= 62.67，P < 0.05），见图8。

图7 各组小鼠体内肿瘤的大小Fig.7 Size of tumors in mice of various groups

图8 各组小鼠的存活率Fig.8 Survival rates of mice in various groups

3 讨论

溶瘤流感病毒由于具有良好的免疫调节作用，病毒基因不会整合入宿主基因组及导致慢性疾病的特点，成为溶瘤病毒的优良备选，但其对肿瘤组织的靶向性不足，较大程度限制了溶瘤效力。针对流感病毒靶向性，采用基因工程技术向流感病毒内引入了靶向肿瘤组织新生血管和肿瘤组织的RGD 序列，以期增强流感病毒对于肿瘤组织的靶向性。

本实验结果表明，与野生型流感病毒比较，重组RGD 流感病毒对肿瘤细胞的亲嗜性及对荷瘤小鼠的保护方面未发生改变。LDH 是细胞胞内较为稳定的酶，在细胞凋亡或坏死过程中细胞膜结构会被破坏，导致细胞浆内的LDH 释放至培养液中。通过检测从流感病毒感染后质膜破裂的细胞中释放至培养液中的LDH 释放率来反映流感病毒对细胞的杀伤力。本研究表明，与相应野生型流感病毒组比较，重组RGD 流感病毒组B16-F10 细胞中LDH 释放率明显升高（P < 0.05），A549 细胞中LDH 释放率略升高，但差异无统计学意义（P > 0.05），其他细胞中LDH 释放率均较低，表明RGD 的引入使流感病毒对B16-F10 细胞的杀伤力增强。

本研究对多种细胞亲嗜性检测结果显示，重组RGD 流感病毒对B16-F10 细胞具有更好的吸附能力和更强的杀伤力，其原因可能是重组RGD 的流感病毒能更好地与高表达αvβ3 整合素黑色素瘤细胞吸附［21］，从而更高效地杀死肿瘤细胞。因此，后续试验选择B16-F10 细胞经皮下移植小鼠，建立了肿瘤模型，初步检测溶瘤性流感病毒对肿瘤增殖的影响，结果表明，RGD 修饰的流感病毒在体内并未呈现出更好的溶瘤效果，这与细胞水平的重组RGD 流感病毒较强的肿瘤细胞杀伤活力有差异，推测这与体内复杂的环境与影响因素有关。另外，考虑到RGD 序列主要是通过识别肿瘤组织新生血管标志物而促进病毒的肿瘤靶向性，本研究体内试验中采用的是瘤内注射方式直接将病毒送入肿瘤组织，未充分体现其靶向的能力。

综上所述，本研究拯救的重组RGD 流感病毒可作为进一步基因工程修饰的基础，在此基础上进行肿瘤细胞毒力及免疫调控基因修饰，为流感病毒溶瘤使用提供了新思路。在今后的研究中，将为重组RGD流感病毒增加荧光标记或荧光基因表达，在体内输送时用于示踪，验证RGD 对肿瘤组织的靶向性；其次重点调整给药方式，采用系统给药的方式验证其靶向能力。