复发性脑胶质瘤组织TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表达与细胞增殖侵袭恶性行为的关系及预测预后的效能

胡杜鹃 任娟

脑胶质瘤是临床常见中枢神经系统恶性肿瘤，发病率达全部颅内肿瘤的50%以上[1]。目前手术联合放化疗是临床治疗脑胶质瘤主要手段，但此疾病恶性程度高，且呈弥漫性浸润，治疗难度大，术后易复发，患者预后差。因此，如何能有效评估患者预后转归以积极完善治疗方案对确保此类患者预后尤为重要。四跨膜超家族成员1蛋白(TM4SF1)是一种肿瘤相关抗原，最早被发现于人上皮来源的恶性肿瘤内。研究显示，TM4SF1 mRNA在肝癌、结肠癌等恶性肿瘤组织内高表达，可促进恶性细胞侵袭、迁移[2]。miR-542-3p是miRNA家族成员，岑小宁等[3]指出，其在肠癌细胞内高表达可降低恶性细胞迁移能力，并提出miR-542-3p表达可能与恶性细胞迁移行为有关。锌是细胞生长、分化、发育所必需的微量元素。有研究表明，肿瘤内常出现锌离子水平异常情况，且此特征与锌转运体1(ZnT1)活性关系密切[4]。本研究探讨复发性脑胶质瘤组织TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表达与细胞增殖侵袭恶性行为的关系及预测治疗反应性的效能，为临床完善相关诊疗机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年3月至2020年3月我院收治的169例复发性脑胶质瘤患者，根据6个月预后情况分为死亡组、生存组。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①初诊经病理诊断确诊脑胶质瘤[5]，术后治疗首次复发；②满足二次手术指征；③卡氏(KPS)功能状态评分≥60分；④患者、家属知情理解签署同意书。

1.2.2 排除标准：①伴肝肾心等主要脏器严重疾病者；②有脑梗死、脑膜炎等其他脑部疾病者；③有精神疾病及认知障碍者；④伴其他恶性肿瘤疾病者。

1.3 方法 术中留取脑胶质瘤组织标本，取50 g标本加入自动匀浆器匀浆，孵育5 min(15～30℃)，待完全裂解，离心(10 min，转速12 000 r/min，半径10 cm)提取RNA，纯化，反转录，孵育(37℃)50 min，保温(70℃)10 min，反应结束将cDNA置-20℃保存。采用赛默飞世尔中国荧光定量PCR仪(7500型)测TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p。扩增程序95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，45个循环。TM4SF1引物设计：上游引物5’-TCGGCCAGTGGAACTACACCTTT-3’，下游引物5’-TCCACCAAGAGCCAAGAGGATAGA-3’；ZnT1 引物设计：上游引物5’-TGATGGCTATTATGGACGAG-3’，下游引物5’-GGAGCGTTTCCCAAGC-3’；miR-542-3p引物设计：上游引物5’-GGCGGTGTGACAGATTGATAA-3’，下游引物5’-TCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTCAG A-3’。

1.4 观察指标 (1)比较2组基线资料、组织各指标。(2)比较组织各指标不同表达水平对细胞增殖侵袭恶性行为的影响。细胞增殖侵袭恶性行为采用2016年世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分类标准[6]进行评价。(3)分析预后影响因素及组织各指标预测预后的效能。(4)对比各指标不同表达水平患者生存率。

2 结果

2.1 2组基线资料、组织各指标比较 169例复发性脑胶质瘤患者，随访6个月，失访2例，167例获访患者中，死亡25例，生存142例。2组年龄、性别、体质量指数、KPS评分、合并疾病、肿瘤位置、术后辅助治疗比较，差异无统计学意义(P>0.05)；死亡组距离首次手术时间、脑胶质瘤WHO分级、肿瘤切除程度、TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表达与生存组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组基线资料、组织各指标比较

2.2 各指标不同表达水平对细胞增殖侵袭恶性行为影响 以2组TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表达均值为分界进行分层，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p高表达与低表达患者WHO分级比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 预后影响因素的Cox比例风险回归模型分析 以预后情况作为因变量(0=生存，1=死亡)，以2组比较筛查出的有统计学意义的指标：TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p作为自变量(低表达赋值1，高表达赋值为2)，建立Cox比例风险回归模型，结果显示，将距离首次手术时间、脑胶质瘤WHO分级、肿瘤切除程度控制后，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p仍与患者预后相关，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 预后影响因素的Cox比例风险回归模型分析

2.4 各指标预测预后的效能 以死亡组为阳性样本，以存活组为阴性样本，绘制各指标预测预后的ROC曲线，结果显示，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p预测预后的AUC分别为0.829、0.798、0.759(P<0.05)；采用联合应用ROC理论模式，对各单独应用指标进行综合回归，建立Logistic预测评估模型，结果显示，TM4SF1 mRNA+ZnT1 mRNA+miR-542-3p预测预后的AUC为0.938(P<0.05)。见表4，图1。

表4 ROC分析结果

图1 组织各指标预测预后的效能

2.5 各指标不同表达水平患者生存率比较 根据ROC分析cut-off值，将患者分为TM4SF1 mRNA高危(>2.07)与低危(≤2.07)、ZnT1 mRNA高危(>0.76)与低危(≤0.76)、miR-542-3p高危(≤0.74)与低危(>0.74)患者生存率，应用K-M生存曲线分析，结果显示，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p高危患者生存率与低危患者比较，差异有统计学意义(χ2=9.377、6.789、14.869，P=0.002、0.009、<0.001)。见图2～4。

图2 不同TM4SF1 mRNA表达者生存率比较 图3 不同ZnT1 mRNA表达者生存率比较 图4 不同miR-542-3p表达者生存率比较

3 讨论

脑胶质瘤常呈浸润性生长，无显著界限，具高复发率、病死率，低治愈率等特征[7]。有研究显示，脑胶质瘤3年生存率不足9%[8]。本研究对复发性脑胶质瘤患者再手术后随访发现，6个月病死率即达14.97%。上述研究均提示临床急需加强对脑胶质瘤恶性行为相关研究并有效指导临床完善此疾病诊疗机制，以提升患者生存率。

TM4SF1 mRNA定位在人3号染色体上，可编码TM4SF1低分子糖蛋白。近年研究发现，TM4SF1在多种恶性肿瘤发生发展过程中具有重要作用，如：TM4SF1被募集到TERM区及相关泛素化修饰后可刺激恶性细胞发生迁移，但其与复发性脑胶质瘤恶性行为间关系如何，尚无定论[9]。本研究发现，随TM4SF1 mRNA表达升高，脑胶质瘤WHO分级呈升高趋势，且生存与死亡患者间复发性脑胶质瘤组织内TM4SF1 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)，提示TM4SF1 mRNA过表达可能与脑胶质瘤恶性行为有关。分析主要是因TM4SF1 mRNA高表达可显著增强脑胶质瘤细胞侵袭，同时其在肿瘤血管内皮细胞中亦呈高表达状态可促进血管新生，而脑胶质瘤发生发展过程中，病理性血管新生及恶性细胞侵袭性均起到关键性作用[10]。因此，脑胶质瘤组织TM4SF1 mRNA高表达时可能通过促进恶性细胞侵袭及病理性血管生成两个层面而增加复发风险，或可为临床完善此疾病诊疗机制提供参考。

ZnT1与脑中锌离子代谢关系密切，是锌转运体家族主要成员。目前ZnT1已得到广泛证实，可通过调节CDK2活性而影响G1/S期转化，同时能通过影响基质金属蛋白酶活性而调节细胞侵袭能力[11,12]。本研究对不同预后的脑胶质瘤患者进行研究发现，死亡组ZnT1 mRNA表达高于生存组(P<0.05)，初见此结果与锌元素有助于维持细胞正常生理功能的特性相悖，但结合现有研究[13,14]不难分析，脑胶质瘤细胞在快速增殖及发生侵袭行为的同时，机体通过一系列生理功能对抗脑胶质瘤细胞增殖，故脑胶质瘤恶性程度越高，ZnT1 mRNA表达随之越高，但此疾病发生发展是多因素、多过程作用的结果，单纯ZnT1 mRNA高表达难以阻止其恶性行为。

此外，miR-542-3p是一种新发现微小mRNA，通过研究其生物学特性发现，miR-542-3p可与凋亡抑制基因Survivin所编码mRNA 3’端非编码区选择性结合，继而抑制Survivin蛋白生成。有研究显示，脑胶质瘤组织内miR-542-3p表达显著降低，miR-542-3p表达降低程度与预后不良有关[15]。本研究亦发现miR-542-3p低表达时脑胶质瘤WHO分级偏高，说明miR-542-3p可能具有抑癌基因作用，其表达降低时可致机体抗脑胶质瘤发生发展能力减弱，此结论同样可部分解释ZnT1 mRNA高表达时，脑胶质瘤细胞恶性行为活跃的原因。结合以上TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表达在复发性脑胶质瘤组织中的生物学特征，或可应用于预后评估。但还有研究显示，肿瘤切除程度、脑胶质瘤WHO分级等均与复发性脑胶质瘤患者预后有关，肿瘤切除程度越高越利于控制病情[16]。Cox比例风险回归模型校正距离首次手术时间、脑胶质瘤WHO分级、肿瘤切除程度后，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p仍与患者预后相关，且联合预测预后的AUC为0.938，大于单一指标预测(P<0.05)，提示TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p与预后有关，联合检测可为临床评估预后提供客观依据，因此，针对TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA升高，miR-542-3p降低的高危患者，需积极完善治疗方案以确保患者能获益最大化。

综上可知，脑胶质瘤组织TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表达与细胞增殖侵袭恶性行为关系密切，是预后的主要影响因素，三者联合可为临床预测预后提供参考依据。