circSAMD4A靶向miR-410-3p对缺氧缺糖诱导的神经细胞损伤的影响

刘园园 张培培 陈忠美

缺血性中风发生时，部分脑部供血减少，导致葡萄糖和氧气供应不足，最终导致脑损伤。重组组织型纤溶酶原激活剂是目前惟一确立的脑卒中治疗药物，但由于时间窗限制具有较大的局限性[1]。脑损伤相关神经功能障碍影响患者的语言、认知和运动功能，严重降低患者生活质量。环状RNA(circRNA)是一类通过特殊的选择性切割机制产生的非编码RNA。circRNA可与特定的微小RNA(miRNA)结合，阻止miRNA翻译，并影响细胞增殖、凋亡、自噬等生物学过程，进而在心血管疾病、神经系统疾病、癌症的病理过程中发挥作用[2-4]。研究报道急性心肌梗死大鼠心肌组织和缺氧复氧诱导的心肌细胞中circRNA SAMD4A(circSAMD4A)抑制水平上调，circSAMD4A低表达可降低缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡和炎性反应[5]。靶基因数据库预测到miR-410-3p是circSAMD4A的潜在靶点。研究发现，糖氧剥夺的原发皮层神经元中miR-410-3p水平显著下调，过表达miR-410-3p可增强神经元存活，抑制神经元凋亡，增加轴突长度，并显著恢复缺氧缺血性脑损伤大鼠的运动和认知功能[6]。本研究利用PC-12细胞建立体外缺氧缺糖细胞损伤模型模拟缺血性脑损伤过程[7]，研究circSAMD4A靶向miR-410-3p对缺氧缺糖神经细胞凋亡和氧化应激的影响，旨在为缺血性脑损伤治疗开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大鼠PC12细胞购自中国典型培养物保藏中心；EBSS无糖培养基、高糖DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；circSAMD4A的小干扰RNA(si-circSAMD4A)、miR-410-3p模拟物(mimics)、miR-410-3p抑制物(anti-miR-410-3p)以及各自阴性对照(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC)、荧光素酶报告质粒购自上海生工生物工程公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒购自北京Takara生物公司；SYBR green master mix试剂盒购自南京诺唯赞生物科技公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自武汉金开瑞生物公司；兔源Cleaved-caspase3抗体、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自美国CST公司；TRIzol试剂、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒以及丙二醛(MDA)检测试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液购自北京索莱宝生物公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于北京全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、模型构建和实验分组:PC12细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于含5%CO2、37℃培养箱中培养，细胞贴壁达到80%时进行传代培养。将对数期PC12细胞接种到6孔板，每孔2×105个细胞，当细胞贴壁40%时Lipofectamine 2000分别转染si-NC、si-circSAMD4A、miR-NC、miR-410-3p mimics、si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p至PC12细胞，收集转染48 h的PC12细胞进行后续实验。参照文献[7]方法构建缺氧缺糖模型，即将PC12细胞接种培养板，HANKs液去除悬浮细胞，用EBSS无糖培养基替代DMEM培养基，放入含5% CO2与95% N2的密闭小室中缺糖缺氧损伤4 h，然后取出培养板置于常规培养箱中复氧继续培养2 h，记为模型(Model)组。用普通高糖DMEM培养基于常规培养箱中培养PC12细胞记为对照(Con)组。转染si-NC、转染si-circSAMD4A、转染miR-NC、转染miR-410-3p mimics、转染si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p的PC12细胞进行缺糖缺氧损伤4 h，再复氧继续培养2 h，分别记为Model+si-NC组、Model+si-circSAMD4A组、Model+miR-NC组、Model+miR-410-3p组、Model+si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p组。

1.2.2 实时定量PCR(RT-qPCR)检测circSAMD4A、miR-410-3p表达:用TRIzol试剂从各组PC12细胞中提取总RNA，然后利用反转录试剂盒将总RNA反转录成互补DNA。利用SYBR green master mix试剂盒进行RT-qPCR检测circSAMD4A、miR-410-3p表达水平。实验所用引物序列(5’-3’)：circSAMD4A上游ACTGGCAGGACAAAAGCATG，下游CAGGATTTTGGGCAGCAGTT；GAPDH上游CAGGAGGCATTGCTGATGAT，下游GAAGGCTGGGGCTCATTT；miR-410-3p上游AAUAUAACACAGAUGG，下游CCTGGCAGTGATGTTGCGGTCTGCCAGGACAGG；U6上游TGGAGCTGCAGAGGATGATT5，下游CAGGGCCTTGAGCACCAGTT。采用2-ΔΔCt法分析circSAMD4A、miR-410-3p的相对水平。circSAMD4A水平检测以GAPDH为内参，miR-410-3p水平检测以U6为内参。

1.2.3 MTT法检测细胞活力:每组取5×103个PC12细胞接种6孔板，用20 μl的MTT工作液孵育细胞4 h，向各孔内加入二甲基亚砜150 μl。低速摇床震荡10 min，当蓝紫色甲赞结晶溶解后。使用酶标仪检测各组PC12细胞在490 nm处光密度(OD)值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率:收集各组PC12细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次，然后重悬于1×结合缓冲液中，调整细胞中浓度为1×10个/ml。按照Annexin V-FITC/PI双染法凋亡检测试剂盒说明书，将5 μl的Annexin V-FITC、5 μl的PI依次加到100 μl细胞悬液中，避光孵育20 min。补加400 μl的1×结合缓冲液混匀，流式细胞术检测各组PC12细胞凋亡率。

1.2.5 蛋白质印迹法检测Cleaved-caspase3蛋白表达:BCA试剂盒检测RIPA裂解法提取的各组PC12细胞总蛋白浓度。将适量蛋白样品与上样缓冲液等体积混匀，100℃水浴锅孵育3～5使蛋白变性。30 μg蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压100 V，时间90 min)分离，经湿法转膜仪(20 mA，过夜)转移蛋白至PVDF膜。膜阻断后，将膜上的蛋白与1∶1 000的Cleaved-caspase3抗体、GAPDH抗体在4 ℃孵育过夜。第2天与二抗室温孵育2 h。化学发光试剂盒进行显色反应，以Image J软件测得的Cleaved-caspase3和GAPDH条带灰度值比值表示目的蛋白水平。

1.2.6 试剂盒检测SOD和CAT活性、MDA含量以及LDH释放量:收集各组PC12细胞，离心后取上清置于新的离心管内，LDH活性检测试剂盒分析上清中LDH水平以表示LDH释放量。向细胞沉淀中加入提取液，200 W超声(超声3 s，间隔10 s，重复 30 次)于冰上破碎细胞，8 000 g 4℃离心10 min，取上清置于冰上。SOD、CAT活性检测试剂盒、MDA检测试剂盒分析细胞内SOD和CAT活性以及MDA含量。

1.2.7 双荧光素酶报告实验:根据starbase数据库预测的circSAMD4A和miR-410-3p的结合位点，将包含miR-410-3p结合位点的circSAMD4A野生(wt)序列以及不含结合位点的circSAMD4A突变(mut)序列分别克隆到pmirGLO基本载体，构建wt-circSAMD4A、mut-circSAMD4A荧光素酶报告质粒。将miR-410-3p mimics、miR-NC分别与wt-circSAMD4A或mut-circSAMD4A共转染PC12细胞中，收集转染48 h细胞，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组PC12细胞的相对荧光素酶活性。

2 结果

2.1 干扰circSAMD4A对缺糖缺氧处理的PC12凋亡的影响 与Con组比较，Model组PC12细胞活力、miR-410-3p表达水平显著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达水平、circSAMD4A表达水平显著升高(P<0.05)；与Model组、Model+si-NC组比较，Model+si-circSAMD4A组PC12细胞活力、miR-410-3p表达水平显著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达水平、circSAMD4A表达水平显著降低(P<0.05)。见图1，表1。

蛋白质印迹法检测Cleaved-caspase3蛋白表达

表1 干扰circSAMD4A抑制缺糖缺氧诱导的PC12凋亡

2.2 干扰circSAMD4A对缺糖缺氧处理的PC12氧化应激的影响 与Con组比较，Model组PC12细胞中SOD和CAT活性显著降低(P<0.05)，MDA水平、LDH释放量显著增加(P<0.05)；与Model组、Model+si-NC组比较，Model+si-circSAMD4A组PC12细胞中SOD和CAT活性显著升高(P<0.05)，MDA水平、LDH释放量显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 干扰circSAMD4A减轻缺糖缺氧诱导的PC12氧化应激

2.3 circSAMD4A靶向miR-410-3p starbase数据库预测到circSAMD4A序列中含有miR-410-3p的结合位点。同与wt-circSAMD4A共转染，与转染miR-NC比较，转染miR-410-3p mimics后PC12细胞对的相对荧光素活性显著降低(P<0.05)；同与mut-circSAMD4A共转染，转染miR-410-3p mimics后PC12细胞相对荧光素活性与转染miR-NC比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表3。

图2 circSAMD4A和miR-410-3p互补序列

表3 双荧光素酶报告实验

2.4 抑制miR-410-3p逆转干扰circSAMD4A对缺糖缺氧处理的PC12凋亡、氧化应激的影响 与Model+si-circSAMD4A组比较，Model+si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p组PC12细胞活力、miR-410-3p表达水平以及SOD、CAT活性显著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达水平、MDA水平、LDH释放量显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4，图3。

表4 抑制miR-410-3p可逆转干扰circSAMD4A对缺糖缺氧诱导的PC12凋亡和氧化应激的抑制作用

流式细胞术检测细胞凋亡 蛋白质印迹法检测Cleaved-caspase3蛋白表达

2.5 miR-410-3p对缺糖缺氧处理的PC12凋亡氧化应激的影响 与Model组、Model+miR-NC组比较，Model+miR-410-3p组PC12细胞活力、miR-410-3p表达水平以及SOD、CAT活性显著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达水平、MDA水平、LDH释放量显著降低(P<0.05)。见图4，表5。

表5 miR-410-3p抑制缺糖缺氧诱导的PC12凋亡和氧化应激

流式细胞术检测细胞凋亡 蛋白质印迹法检测Cleaved-caspase3蛋白表达

3 讨论

脑组织circRNA含量丰富，这些circRNA不仅与神经系统发育、分化和生物学功能有关，在脑损伤后神经系统功能障碍和病理中发挥重要作用[8]。研究发现circRNA 丝氨酸/苏氨酸蛋白扰动样激酶1(circTLK1)在缺血性脑卒中动物模型和患者的脑组织和血浆中水平升高，敲减circTLK1可显著减少梗死体积，减轻神经元损伤，改善随后的长期神经功能缺损[9]。circRNA HECTD1(circHECTD1)通过调节星形胶质细胞激活加重缺血损伤[10]。此外，circRNA DLGAP4(circDLGAP4)通过靶向miR-143调节与血脑屏障完整性相关的内皮-间充质转化，改善缺血性卒中预后[3]。本研究发现缺氧缺糖诱导的PC12细胞中circSAMD4A水平增加，提示circSAMD4A表达改变可能与缺血性脑损伤相关。功能丧失实验显示，转染si-circSAMD4A干扰circSAMD4A表达显著减轻缺氧缺糖诱导的细胞凋亡，增加细胞活力。干扰circSAMD4A表达后Cleaved-caspase3表达下调，证实其可逆转细胞凋亡。多项研究表明，circSAMD4A在骨肉瘤中参与调节细胞增殖、细胞周期和凋亡[11,12]。氧化应激在缺氧缺糖诱导的细胞凋亡中起着重要作用[13]。本研究显示，缺氧缺糖诱导细胞损伤标志物LDH释放，增加脂质过氧化终产物MDA水平，降低抗氧化酶SOD和CAT活性，而干扰circSAMD4A表达显著逆转了缺氧缺糖诱导的上述改变。因此，干扰circSAMD4A表达通过抑制氧化应激和凋亡在缺氧缺糖诱导的细胞损伤中发挥神经保护作用。

circRNA可作为miRNA海绵，通过竞争性结合miRNA间接调控miRNA靶基因的表达，参与缺血性脑损伤过程，例如circHECTD1能够负向调控miR-133b表达加剧大脑中动脉闭塞小鼠模型的脑梗死面积和神经元凋亡[14]。本研究证实miR-410-3p受circSAMD4A调控，是circSAMD4A的直接靶标。据报道，miR-410-3p在七氟醚麻醉诱导的大鼠和细胞中下调，并在七氟醚麻醉诱导的海马神经元凋亡和炎症中发挥抑制作用[15]。肝刺激因子通过上调miR-410-3p等几种miRNA表达，抑制周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)水平，抑制肝细胞凋亡，进而减轻肝脏缺血再灌注损伤[16]。本研究表明，缺氧缺糖诱导的PC12细胞中miR-410-3p水平降低，过表达miR-410-3p可提高SOD和CAT活性，降低MDA水平，抑制LDH释放，改善缺氧缺糖诱导的凋亡和氧化应激损伤。由于干扰circSAMD4A表达可增加缺氧缺糖PC12细胞中miR-410-3p水平，且过表达miR-410-3p和干扰circSAMD4A的神经保护作用类似，表明可能存在circSAMD4A/miR-410-3p调控途径。进一步研究发现，抑制miR-410-3p表达可减弱干扰circSAMD4A对缺氧缺糖诱导的PC12细胞损伤的保护作用，这表明circSAMD4A靶向负调控miR-410-3p表达参与调控缺氧缺糖诱导的神经细胞损伤。

综上所述，本研究首次证实干扰circSAMD4A通过靶向miR-410-3p可减轻缺糖缺氧诱导的神经细胞损伤，具有神经保护作用。靶向抑制circSAMD4A/miR-410-3p途径可能是预防或治疗缺血性脑损伤的有效途径。