阿昔莫司对oxLDL诱导泡沫细胞自噬及AMPK/mTOR通路的影响

杨少君 周乃珍 王晓霞

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是缺血性心血管疾病的潜在病理特征，是目前全球范围内病死率最高的疾病[1]。当巨噬细胞大量吸取来自于人体内氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL)时，会极大地增加巨噬细胞中的脂滴含量[2]，进而发展成为具有AS特征的巨噬源性泡沫细胞，最终形成AS[3]。避免AS的发生，减少泡沫细胞形成[4]，是目前科学家们关注的焦点。大量研究表明，自噬可参与调节AS的发生发展过程，并且抑制自噬会加速AS的发展，促进自噬则可抑制AS[5]。AMPK/mTOR通路是参与细胞自噬调节的通路[6]，已有研究证明阿托伐他汀可通过此通路激活细胞自噬，进而延缓AS进程[7]。阿昔莫司是一种烟酰类的降脂药，可参与调控心血管疾病发生，有研究发现，阿昔莫司可明显降低大鼠高脂饮食造成的血脂升高及颈动脉粥样硬化[8]。本研究通过探究阿昔莫司对oxLDL诱导泡沫细胞自噬的影响，并进一步探究AMPK/mTOR通路在此过程中的作用，为阿昔莫司治疗AS的分子机制提供新依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人单核细胞株THP-1购自武汉益普科技生物有限公司(货号：YCL-0233)；10%胎牛血清购自美国GEMINI(货号：900-108)；0.25%胰蛋白酶购自美国Hyclone(货号：SH30042.01B)；RPMI-1640培养基购自北京百奥莱博(货号：GL0182-LWE)；阿昔莫司购自美国NIFDC(货号：CP-100750)；氯喹购自美国MP Biomedicals(货号：0219391910)；佛波醇酯购自中国absin(货号：abs9107)；oxLDL购自上海经科(货号：JK-002)；油红O染色试剂盒购自美国Sciencell(货号：SC-0843)；LC3、P62、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、GAPDH抗体均购自中国Bioss；AMPK抑制剂Compound C购自美国Merck(货号：171260-1MG)；HRP标记山羊抗兔IgG购自中国万类生物(货号：WLA023)；聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)购自美国Millipore(货号：IPVH00010)；ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天(货号：P0018FM)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:在RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)中培养人单核细胞株THP-1，在37℃培养箱培养，当单核细胞生长面积>80%培养瓶面积后，进行1次传代培养(具体详细操作步骤参考购买细胞时附带的细胞培养操作指南)。

1.2.2 细胞分组与处理:收集对数期THP-1细胞，添加佛波醇酯(100 ng/ml)培养48 h诱导形成巨噬细胞，将巨噬细胞分为空白组(不添加oxLDL)、对照组、阿昔莫司组、氯喹组、阿昔莫司+氯喹组、Compound C(AMPK抑制剂)组、阿昔莫司+Compound C组，各组均添加对应药物作用于细胞0.5 h，随后再添加oxLDL(50 mg/L)培养48 h。

1.2.3 油红O染色检测细胞内脂滴含量:收集培养后的空白组、对照组细胞，使用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定30 min。再次用PBS冲洗3次，油红O进行染色大约30 min，60%异丙醇进行冲洗5 s，然后立即使用PBS进行漂洗3次，最后使用苏木素复染3～5 s，迅速使用流水冲洗，最后在显微镜下拍照观察。

1.2.4 透射电子显微镜观察细胞内超微结构:收集培养后的空白组、对照组细胞，用4%戊二醛固定后用PBS漂洗，然后添加1%饿酸固定，用一定浓度梯度的乙醇丙酮脱水，随后包埋，切片，最后再将切片用乙酸双氧铀及柠檬酸铅染色，于电子显微镜下观察自噬体结构。

1.2.5 Western Blot检测细胞中自噬相关蛋白LC3、P62及AMPK/mTOR通路相关蛋白p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR表达:收集培养后的对照组、阿昔莫司组、氯喹组、阿昔莫司+氯喹组、Compound C组、阿昔莫司+Compound C组细胞，分别加入裂解液充分裂解细胞，使用蛋白提取试剂盒依次提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定各组蛋白浓度，经电泳、转膜、封闭过程后，依次添加LC3、P62、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、GAPDH抗体(GAPDH作为内参)，4℃孵育过夜后，添加二抗，然后使用ECL发光液显色，最后采用凝胶成像系统扫描图像并分析各目的蛋白表达。

2 结果

2.1 油红O染色检测泡沫细胞模型构建结果 THP-1细胞添加佛波酯诱导后又添加oxLDL培养，与空白组比较，对照组细胞红色脂滴含量明显提高(P<0.05)，标志着泡沫细胞模型成功构建。见图1，表1。

表1 细胞内红色脂滴含量比较

空白组 对照组

2.2 透射电子显微镜观察细胞内超微结构 oxLDL诱导巨噬细胞后，透射电子显微镜观测细胞内的超微结构。空白组中并未见到自噬体。与空白组比较，对照组细胞内自噬体数量明显增多(箭头所示)，发现添加oxLDL可增加THP-1细胞自噬。见图2。

空白组 对照组

2.3 阿昔莫司对oxLDL诱导后细胞中自噬相关蛋白表达的影响 与对照组比较，阿昔莫司组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高(P<0.05)，P62水平降低(P<0.05)，而氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低(P<0.05)，P62水平升高(P<0.05)；与阿昔莫司组比较，阿昔莫司+氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低(P<0.05)，P62水平升高(P<0.05)。见图3，表2。

表2 4组细胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62蛋白表达量比较

图3 Western Blot检测细胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62蛋白水平

2.4 阿昔莫司对oxLDL诱导后细胞中自噬及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达的影响 与对照组比较，阿昔莫司组p-AMPK/AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR和P62水平降低(P<0.05)；Compound C组p-AMPK/AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平显著降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR和P62水平升高(P<0.05)。与阿昔莫司组比较，阿昔莫司+Compound C组p-AMPK/AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR和P62水平升高(P<0.05)。见图4，表3。

图4 Western Blot检测细胞中p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62水平

表3 4组细胞中p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62蛋白表达量比较

3 讨论

AS属于血管炎症疾病的一种，严重威胁人类身体健康[9]，其特征主要是血管壁中大量积聚脂质、纤维性物质以及矿物质等物质，产生AS损伤有多方面的原因，其中由单核细胞浸润转变为的巨噬源性泡沫细胞在此过程中至关重要[10]。大量的脂质沉积引起巨噬细胞中胆固醇脂含量升高，进而形成泡沫细胞，泡沫细胞的形成是AS早期的主要特征之一，参与AS的发生发展过程[11]。有文献报道，通过使用诱导成为巨噬细胞，进而添加oxLDL诱导48 h形成泡沫细胞，通过油红O染色发现细胞内有大量的红色脂滴，则成功构建泡沫细胞模型[2]。本研究结果显示，对照组细胞内有大量的红色脂滴，且显著高于空白组，与之前报道结果相同，验证了泡沫细胞模型的成功构建。

自噬是机体内一种高度保守的溶酶体降解机制，在维持细胞完整性和能量稳态方面起着至关重要的作用[12]，在生物发育及衰老过程中均有可能会发生，是净化机体自身的一个必要循环机制[13]。在研究自噬机制中广泛使用的分子标志蛋白有：LC3，Beclin1，P62(SQSTM1)，Atg32等多个因子[14]，本研究主要选用LC3和P62蛋白。已有研究证明，LC3在形成自噬体膜过程中具有重要作用，主要表现为LC3Ⅱ和LC3Ⅰ两种相互转换的形式，检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平可直接反映其自噬水平[15]。P62可以用来作为货车蛋白，它参与机体多种信号的转导途径，且在多种细胞中均能检测到其表达[16]。P62可以直接与LC3泛素化底物直接作用后进入到自噬体中，进而被其他自噬溶酶体降解，P62蛋白水平在一定意义上可反映出自噬的能力变化[17]。已有研究证实，阿昔莫司可以有效地改善高脂饮食大鼠所引起的血脂水平提高[8]。且阿昔莫司能够通过激活LXRα通路，诱导ABCA1表达，进而抑制其形成泡沫细胞达到延缓AS发生发展的目的[18]。本研究发现，与对照组比较，阿昔莫司组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达明显提高，P62表达显著降低，而氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达降低，P62水平升高；与氯喹组比较，阿昔莫司+氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高，P62水平降低。此结果表明了阿昔莫司可抑制形成泡沫细胞且可以在一定程度上削弱氯喹对细胞自噬的抑制作用。

本研究为了更深入的探讨阿昔莫司与细胞自噬的作用机制，进一步探究了AMPK/mTOR通路对此过程的作用。已有多篇研究报道AMPK/mTOR通路可参与多种疾病过程，也可参与细胞自噬过程[19]。有研究证明，在培养人肺癌细胞A549细胞中，外源添加槲皮素和AMPK抑制剂Compound C后，可降低p-AMPK蛋白水平，升高p-mTOR蛋白水平，且A549细胞自噬泡明显减少，进而得出槲皮素可能通过激活AMPK/mTOR信号通路诱导A549细胞发生自噬过程[20]。本研究证明了阿昔莫司可以激活AMPK/mTOR通路，可通过此通路在一定程度上增强泡沫细胞的自噬作用。

综上所述，阿昔莫司可通过调控AMPK/mTOR通路促进oxLDL诱导的泡沫细胞自噬作用。本研究为阿昔莫司在治疗AS机制中提供了新的见解，且对AMPK/mTOR通路研究开辟了新的研究方向。但本研究并未深入探究是否还有其他的通路蛋白参与调控细胞自噬，有待后续更加完善的研究。