circ_0003645靶向miR-578调控胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制研究

潘彦波 张春雷 马俊 王昶

恶性胶质瘤是临床常见的难治性中枢神经系统肿瘤，其恶性程度高、难治愈，目前靶向治疗可延长使患者的中位无进展生存期及中位总生存期[1,2]。因此，研究胶质瘤的分子机制，开发新的靶点以对胶质瘤的靶向治疗具有重要意义。研究表明，circRNA在肿瘤发生和转移中起重要作用，可抑制肿瘤发生，并可用作治疗靶标[3]。研究报道乳腺癌组织和细胞系中circ_0003645的表达明显增加，circ_0003645通过调节miR-139-3p/HMGB1轴促进乳腺癌的进展[4]。非小细胞肺癌患者组织中circ_0003645的过度表达与晚期TNM分期，阳性淋巴结浸润和不良预后有关；干扰circ_0003645表达可抑制非小细胞肺癌细胞的恶性生物学行为[5]。然而circ_0003645在胶质瘤中的作用，其对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制尚不清楚。研究报道miR-578上调可抑制胶质瘤细胞增殖，促进细胞凋亡[6]。在线生物学软件预测发现circ_0003645与miR-578有结合位点，但circ_0003645与miR-578的关系及circ_0003645调控miR-578影响胶质瘤进展尚不清楚。本实验旨在研究circ_0003645对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制是否与miR-578有关。

1 材料与方法

1.1 试验材料 选取2017年1月至2020年12月我院病理科存档且已确诊脑胶质瘤的组织标本35例，其中男18例，女17例；年龄18～72岁，平均(39.7±2.1)岁。通过内减压术获得正常脑组织标本35例作为对照，其中男19例，女16例；年龄18～56岁，平均(37.4±1.2)岁。所有患者术前无放化疗史。患者均知情且同意。

1.2 细胞与主要试剂 胶质瘤细胞株U251购自美国ATCC；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自美国Progema公司；细胞计数试剂盒8(CCK-8)购自南京赛泓瑞生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel购自美国BD公司；蛋白提取试剂盒购自上海振誉生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国AAT Bioquest公司。

1.3 细胞转染与分组 胶质瘤细胞株U251用RPMI-1640培养基培养，将circ_0003645干扰表达载体质粒及阴性对照、miR-578模拟物及阴性对照转染至U251细胞中，记为si-circ_0003645组、si-NC组、miR-578组、miR-NC组；将circ_0003645干扰表达载体质粒分别与miR-578抑制剂及阴性对照转染至U251细胞中，记为si-circ_0003645+anti-miR-578组、si-circ_0003645+anti-miR-NC组。

1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测circ_0003645和miR-578的表达水平 提取胶质瘤组织、正常脑组织及各组细胞的总RNA，反转录成cDNA，以GAPDH和U6为内参进行PCR，相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

1.5 CCK-8检测细胞活性 各组细胞培养48 h，按试剂盒说明加入 CCK-8试剂，培养2 h，用酶标仪检测450 nm处的吸光度值(OD)。

1.6 克隆形成实验检测细胞克隆形成数 将细胞制成1×104个/ml细胞悬液，以每孔200个细胞接种于6孔板，培养2周后用PBS清洗细胞，用甲醇固定细胞，用吉姆萨染色30 min，在光学显微镜下计数>50个细胞的集落。

1.7 划痕实验检测细胞划痕愈合率 各组细胞消化后接种于培养板，过夜细胞铺满后用枪头直线划痕，用PBS冲洗划下的细胞，换液后继续培养，在培养0 h和48 h后拍照观察，用Image-Pro Plus6.0软件计算划痕愈合率。

1.8 Transwell检测侵袭细胞数 Transwell小室上室加入100 μl稀释好的Matrigel，凝固后加100 μl细胞悬液，下室加500 μl含血清培养液，培养24 h，用0.1%结晶紫染色30 min，棉签擦拭掉上层未穿过基底膜的细胞，光学显微镜(×200)下随机选择5个视野，拍照并计数。

1.9 蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，取50 μl蛋白进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，用封闭液将膜封闭，将封闭后的膜置于含有一抗的杂交袋中置于4℃冰箱中过夜，然后经膜置于含有二抗的杂交袋中在室温下孵育1 h，显影、定影后用Image J分析蛋白条带灰度值，计算蛋白表达水平。

1.10 双荧光素酶报告实验 将circ_0003645的野生型和突变型荧光素酶载体分别与miR-NC或miR-578共转染至U251细胞，按试剂盒说明检测U251细胞的荧光素酶活性。将pcDNA、pcDNA-circ_0003645、si-NC、si-circ_0003645转染至U251细胞，采用qRT-PCR检测miR-578的表达水平。

2 结果

2.1 circ_0003645和miR-578在胶质瘤组织中的表达 胶质瘤组织中circ_0003645表达水平高于正常脑组织，而miR-578表达水平低于正常脑组织(P<0.05)。见表1。

表1 circ_0003645和miR-578在胶质瘤组织中的表达

2.2 干扰circ_0003645表达对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与si-NC组比较，si-circ_0003645组circ_0003645表达水平降低，细胞活性降低，细胞克隆形成数减少，划痕愈合率降低，侵袭细胞数减少，E-cadherin表达水平升高，N-cadherin表达水平降低(P<0.05)。见图1，表2。

图1 干扰circ_0003645表达后迁移侵袭相关蛋白的表达

表2 干扰circ_0003645表达对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.3 miR-578过表达对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响 过表达miR-578后，miR-578表达水平升高，U251细胞的活性降低，细胞克隆形成数减少，划痕愈合率降低，侵袭细胞数减少，E-cadherin表达水平升高，N-cadherin表达水平降低(P<0.05)。见表3，图2。

表3 miR-578过表达对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图2 miR-578过表达后迁移侵袭相关蛋白表达

2.4 circ_0003645靶向调控miR-578的表达 Circular RNA Interactome预测显示circ_0003645与miR-578含有互补的核苷酸序列。WT-circ_0003645与miR-578共转染的U251细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)；过表达circ_0003645后，miR-578表达水平降低；抑制circ_0003645表达后，miR-578表达水平升高(P<0.05)。见表4、5,图3。

表4 circ_0003645野生型与突变型载体与miR-578或miR-NC共转染后的细胞荧光素酶活性

表5 circ_0003645调控miR-578的表达

图3 circ_0003645的序列中含有与miR-578互补的核苷酸序列

2.5 下调miR-578表达逆转了干扰circ_0003645表达对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的作用 与si-circ_0003645+anti-miR-NC组比较，si-circ_0003645+anti-miR-578组miR-578表达水平降低，细胞活性升高，细胞克隆形成数增加，划痕愈合率升高，侵袭细胞数增加，E-cadherin表达水平降低，N-cadherin表达水平升高，组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6，图4。

表6 下调miR-578表达逆转了干扰circ_0003645表达对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的作用

图4 迁移侵袭相关蛋白表达

3 讨论

胶质瘤是恶性脑肿瘤的最常见类型，分子靶向治疗可能是治疗胶质瘤的一种新颖策略[7,8]。研究表明多种circRNA参与调控胶质瘤的恶性生物学行为[9]。研究报道CircNFIX通过调节miR-378e/RPN2轴促进神经胶质瘤的进展[10]。Circ_0005075通过下调SIRT1刺激神经胶质瘤的增殖和转移[11]。circ_0008225通过使miR-890海绵化并促进ZMYND11表达来抑制神经胶质瘤的发生[12]。

本实验结果显示，胶质瘤组织中circ_0003645表达水平升高，提示circ_0003645可能在胶质瘤中起促癌作用。干扰circ_0003645表达后，U251细胞活性及划痕愈合率降低，细胞克隆形成数及侵袭细胞数减少，E-cadherin表达水平升高，N-cadherin表达水平降低；表明扰circ_0003645表达抑制了U251细胞的增殖、迁移和侵袭。

研究报道miR-578过表达可抑制乳腺癌细胞活力，集落形成，迁移，侵袭，并促进细胞凋亡[13]。本实验结果显示，胶质瘤组织中miR-578表达水平降低；过表达miR-578可降低U251细胞活性及划痕愈合率，减少细胞克隆形成数及侵袭细胞数。此外，研究报道circ_001621通过使miR-578海绵化并调节VEGF表达来促进骨肉瘤细胞增殖和迁移[14]。circ_0005785上调通过miR-578/APRIL轴促进肝癌细胞的细胞生长和转移[15]。说明circRNA可通过调控miR-578影响肿瘤进展。本实验发现circ_0003645可靶向调控miR-578的表达；而下调miR-578表达逆转了干扰circ_0003645表达对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

综上所述，干扰circ_0003645表达通过靶向上调miR-578抑制胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭。