滇龙胆草对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的干预作用

皮娜 朱振东 何琴 钟燕 靳璇 张旋

肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是由各种肺内外致病因素所致的慢性、进展性、致死性的间质性肺疾病，可导致患者肺功能不可逆下降、进行性呼吸衰竭，甚至死亡，其治疗困难，预后差，严重危害人类健康[1,2]。因此，肺纤维化也被俗称为不是癌症的癌症。同时，肺纤维化也是发生肺癌的一个重要危险因素，肺纤维化患者继发肺癌的比例远远高于普通人群[3]。因此，对于肺纤维化患者，如何延缓或逆转肺纤维化进程，最大限度地改善肺功能一直是医学界的一个难题。2014年，美国FDA同时批准了两个治疗特发性肺纤维化的新药：吡非尼酮和尼达尼布[4]。然而，这两种新药长期服用会引起一系列不良反应如肝功能损害，而且价格昂贵，普通患者难以承受。因此研发高效、低毒、经济的抗肺纤维化新药十分必要。滇龙胆草(Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.)为龙胆科龙胆属植物，也被称为坚龙胆、苦胆草、小秦艽，为云南道地中药材，主产于云南，在四川、贵州、广西、湖南等地也有分布[5]。滇龙胆草主要以根及根茎入药，味苦、性寒，归肝、胆经。目前滇龙胆草已被《中国药典》收录，作为传统中药材龙胆的重要基源植物。研究表明，从该属植物中分离出的主要生物活性成分为环烯醚萜、黄酮类化合物，具有广泛的药理活性，此外，源于该植物的天然产物没有明显的动物毒性、细胞毒性和基因毒性[6]。在抗纤维化方面，研究发现来源于该植物的苦胆草能改善大鼠肝纤维化程度，对大鼠肺纤维化也有保护作用[7,8]，但作用机制尚不明确。本研究在博莱霉素制备小鼠肺纤维化模型上进一步观察滇龙胆草的抗肺纤维化作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SPF级雄性昆明种小鼠120只，5～7周龄，体重18～22 g，由昆明医科大学实验动物学部提供，实验动物生产许可证号：SCXK(滇)2020-0004。

1.1.2 药物与试剂:滇龙胆草购自昆明市螺蛳湾中药材市场，并经昆明医科大学药学院陆露教授鉴定为滇龙胆，样本编号：20200625；吡非尼酮(PFD)，生产批号：J1001A，购自大连美仑生物技术有限公司；注射用盐酸博莱霉素(BLM)，生产批号：19012311，购自海正辉瑞制药有限公司；苏木精-伊红染色液，生产批号：190815，购自厦门迈威生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，生产批号：090119191205，SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒，生产批号：071820200727，购于碧云天；Masson三色染色试剂盒，生产批号：1911278004，购自福州迈新生物技术有限公司；羟脯氨酸试剂盒(碱水解法)，生产批号：20200722，购自南京建成生物工程研究所；α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，生产批号：QR3252482-10，购自美国Abcom公司 ；GAPDH Rabit Polyclonal antibody，生产批号：10494-1-AP，HRP-偶联Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，生产批号：20000243，购自美国 Proteintech公司；Bio-rad Clarity Western ECL化学发光底物，生产批号：170-5060，购自美国Bio-rad公司；彩虹180广谱蛋白Marker(11-180 KDa)，生产批号：828A021，购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理:小鼠适应性饲养1周开始实验。将小鼠随机分为正常对照组(NS)，模型组(BLM)，吡非尼酮组(PFD)，滇龙胆草低、中、高剂量组(Gen50、Gen100、Gen200)，每组20只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，暴露气管，正常对照组一次性气管内滴注无菌0.9%氯化钠溶液，其余各组一次性气管内滴注博莱霉素5 mg/kg，滴注后立即将小鼠直立旋转，使博莱霉素溶液或0.9%氯化钠溶液均匀分布于肺内。从造模当天开始，滇龙胆草低、中、高剂量组分别灌胃给予50、100、200 mg/kg滇龙胆草0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每日给药1次；对照组和模型组小鼠灌胃给予相应体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液；吡非尼酮组组灌胃给予50 mg/kg吡非尼酮。在给药第14天和第28天，分别麻醉处死每组10只小鼠，收集肺组织标本，进行HE染色、Masson染色、羟脯氨酸(Hyp)检测及Western blot检测。

1.2.2 小鼠行为学观察及体重测量:观察小鼠呼吸、活动及饮食情况，毛发颜色变化。在造模给药第1天称体重，之后每周称一次体重，记录数据。

1.2.3 肺系数:小鼠麻醉处死后，分离肺组织，称量肺脏重量。根据小鼠体重和肺脏重量计算各组小鼠肺系数。肺系数=肺脏重量(mg)/体重(g)×100%。

1.2.4 Hyp含量测定:取每组小鼠右上肺采用碱水解法操作，根据试剂盒说明将组织放入试管中并加入水解液1 ml，沸水浴水解20 min，加指示剂10 μl，调整pH值至6.0～6.8，加双蒸水定容至10 ml并混匀，取3 ml水解液加入活性炭20 mg，3 500 r/min离心10 min，取上清液1 ml按照试剂盒操作加入对应试剂，混匀，水浴离心后取上清于550 nm处做吸光度(A)值检测。

1.2.5 Western blot检测肺组织α-SMA蛋白表达:取小鼠肺组织100 mg，剪碎匀浆，加入蛋白裂解液裂解，收集上清液，采用BCA 定量蛋白试剂盒进行蛋白定量检测。取20 μg蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白组分后，转印蛋白于PVDF膜上。α-SMA(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 500)一抗4℃过夜，TBST漂洗。加入山羊抗兔 IgG-HRP 二抗(1∶5 000)室温下孵育2 h，TBST漂洗，ECL液显影。以GAPDH为内参蛋白，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比定量分析蛋白相对表达水平。

1.2.6 病理组织学观察:肉眼观察肺组织大体病理改变，然后取小鼠左肺，用10%中性甲醛固定液固定24 h 后，由低浓度到高浓度酒精梯度分别脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋组织，蜡块室温冷却后以5 μm厚度切片行常规HE染色和Masson染色，显微镜下分别观察肺组织炎症程度和胶原纤维沉积情况，参照Szapiel等[9]的方法对肺泡炎进行评分，参照Fulmer等[10]的方法对肺间质纤维化程度进行评分。

2 结果

2.1 一般情况 对照组小鼠饮食状况良好、毛发光泽发亮、活动正常、呼吸平稳。模型组小鼠安静少动、精神萎靡、毛发粗糙无光泽，其余组与对照组比较，未见明显变化。

2.2 体重变化 每天观察小鼠的生长情况并每隔一周称量小鼠体重。由生长曲线可见，NS组小鼠体重增长最快而模型组小鼠增长最慢，其余各组增长幅度相似。见图1。

图1 小鼠生长曲线；NS-正常对照组；BLM-模型组；PFD-吡非尼酮组；Gen50-滇龙胆草低剂量组；Gen100-滇龙胆草中剂量组；Gen200-滇龙胆草高剂量

2.3 肺系数 肺系数是表征肺组织水肿程度的重要指标，模型组小鼠肺系数均明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，与模型组比较，吡非尼酮组和滇龙胆草各剂量组小鼠肺系数均有所降低，14 d的吡非尼酮组和滇龙胆草中剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，其余差异无统计学意义(P>0.05)。各组内14 d与28 d比较，14 d各组小鼠肺系数均高于28 d。见表1。

2.4 肺组织Hyp含量 在14 d时，与正常对照组比较，模型组小鼠肺组织Hyp含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.001)；与模型组比较，滇龙胆草高剂量组小鼠肺组织Hyp含量明显降低，差异有统计意义(P<0.01)；随着时间增加，在28 d时，模型组Hyp含量达到峰值，与正常对照组比较，模型组小鼠肺组织Hyp含量明显升高，差异有统计意义(P<0.01)，各药物组与模型组比较，Hyp含量均明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)。结果表明，滇龙胆草可显著降低肺纤维化小鼠肺组织中Hyp含量。见表1。

表1 肺系数和肺组织Hyp含量统计表

2.5 Western blot检测肺组织α-SMA蛋白含量 与正常对照组比较，模型组α-SMA蛋白的表达明显增加(P<0.01)；与模型组比较，滇龙胆草除28 d低剂量差异无统计学意义(P>0.05)，其余各剂量组均能显著降低肺组织中α-SMA的相对表达量(P<0.01)，疗效与吡非尼酮组相当。见图2，表2。

图2 肺组织α-SMA蛋白表达(n=10)

表2 肺组织α-SMA蛋白表达

2.6 肺组织病理学变化 正常对照组小鼠肺组织肺泡结构较完整、清晰，未见肺泡壁增厚肺泡间有少量胶原，无明显炎性细胞浸润。模型组小鼠肺组织结构破坏严重，部分肺泡塌陷融合，肺泡间隔破坏，肺泡壁明显增厚，其间可见纤维组织成条索样、斑片状分布及炎性细胞浸润。随着造模时间延长在肺间质及支气管周围可见大量纤维组织增生和胶原沉积。肺泡炎和组织纤维化评分结果显示，与对照组比较，模型组肺泡炎及间质纤维化评分明显增加；与模型组比较，滇龙胆草中、高剂量组和吡非尼酮组肺泡炎评分明显降低，滇龙胆草低、中、高剂量组和吡非尼酮组间质纤维化评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、4，表3。

表3 肺组织病理形态学评分 n=10,分,

图3 病理学形态(HE染色×200)

3 讨论

肺纤维化的病理改变以普遍间质性肺炎、广泛肺内纤维化和瘢痕化、肺内成纤维细胞和肌成纤维细胞异常增殖及大量细胞外基质聚集于肺泡细胞周围并伴炎症损伤、组织结构破坏，正常肺泡组织被损坏后异常修复导致肺内疤痕形成[11]。持续的炎性损伤、异常的肺泡上皮修复、成纤维细胞的活化和分化是肺纤维化形成的重要病理过程。

图4 病理学形态(Masson染色×200)

博莱霉素是一种用于治疗肿瘤的抗生素，广泛用于治疗某些类型的恶性肿瘤，包括睾丸癌、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤，肺纤维化是其常见不良反应[12]。气管内滴注博莱霉素是一种常用的制备肺纤维化动物模型的经典方法。本研究在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型上评价了不同剂量滇龙胆草对肺纤维化形成的干预作用。病理组织学结果发现，滇龙胆草能够明显减轻肺纤维化早期肺部炎性反应和后期肺内胶原纤维沉积，能够干预肺纤维化的形成。

肺系数是表征肺组织水肿程度和炎症损伤的重要指标。本研究发现，模型组气管滴注博来霉素14 d肺系数明显高于28 d，表明肺纤维化早期主要以炎性反应为主，与模型组比较，不同剂量的滇龙胆草能够降低小鼠肺系数。羟脯氨酸是胶原纤维的重要组成部分，其含量可以反映胶原纤维的含量，常作为纤维化标记物用于表征纤维化组织中胶原蛋白沉积的程度[13]。本研究发现，气管滴注博莱霉素28 d时模型组小鼠肺组织羟脯氨酸达到峰值，不同剂量的滇龙胆草均能明显降低肺纤维化小鼠肺组织的羟脯氨酸含量，表明滇龙胆草能够抑制肺纤维化小鼠肺组织胶原纤维沉积。

活化的肌成纤维细胞是纤维化中最主要的效应细胞，是产生细胞外基质，引起胶原纤维沉积的主要细胞，可特异性表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。肺纤维化时，肺内肌成纤维细胞主要来源与成纤维细胞的增殖分化、肺上皮细胞间质转化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及循环纤维细胞迁移[14,15]。α-SMA异常高表达是成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的标志，也是肌成纤维细胞具有收缩和迁徙能力的结构基础。本研究发现，模型组在气管滴注博莱霉素14 d和28 d时，小鼠肺组织α-SMA表达水平均明显高于正常对照组，表明肺纤维化时肺组织α-SMA表达明显上调，这与文献报道[16]一致。不同剂量滇龙胆草和吡非尼酮均可以明显下调肺纤维化小鼠肺组织α-SMA的表达。结果表明，滇龙胆草可能抑制了肺内成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。

综上所述，滇龙胆草具有抗肺纤维化作用，能够抑制肺纤维化形成早期肺部炎症和后期胶原纤维沉积，其抗肺纤维化作用与下调α-SMA表达，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化有关。本研究可为滇龙胆草防治肺纤维化提供一定的实验依据，为肺纤维化的治疗提供新的治疗策略。