痰液、肺泡灌洗液微生物辅助诊断老年肺结节良恶性的研究

朱颖 黄建峰 张勤 高敏 文昱婷 武良权 蔡伟 张允雷 张秀伟

现阶段临床上肺结节的良恶性辨别以及跟踪监测主要依赖于低剂量螺旋CT和穿刺活检。但是在影像学上观察到恶性肺结节时，少数肺癌的癌干细胞已经成功侵入机体的其他器官，导致肺癌的发生[1]。大规模的临床呼吸道样本微生物16s测序结果表明，微生物的α多样性和分布(均匀度) 在非恶性肺组织中明显高于肿瘤肺组织[2]。然而，与健康人群相比，癌症病例中的几个微生物分类群已被证明是相当丰富的。这些存在于肺癌组织中的定植菌，主要包括 流感嗜血杆菌、 肠杆菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌(G-)[3]。肺癌病人的颗粒杆菌、营养缺陷菌属和链球菌属的丰度明显高于健康人群[4]。更重要的是，肺泡灌洗液中的巨球型菌属、二氧化碳噬细胞菌属、硬壁菌门和韦荣球菌属细菌在预测肺鳞癌和肺腺癌方面已经显示出较高的AUC值，可以被用作肺癌的生物标志物[5]。虽然这些研究结果具有明显的地域性，不同国家和地区的研究结果差别较大。但是，上述研究充分说明痰液和肺泡灌洗液中的微生物中包含着肺癌的“蛛丝马迹”。因此，本研究拟在痰液和肺泡灌洗液的一般细菌涂片检查的结果中探究一种简便快捷、适合老年病人的肺结节良恶性辨别方法。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2020年5月在南京医科大学附属江宁医院初次就诊的94例老年肺癌病人和36例老年肺结节病人为研究对象。纳入标准：年龄>65岁；初次确诊为肺癌或肺结节。排除标准：呼吸道感染和其他恶性肿瘤、严重心脑血管疾病病人等。将120例病人分为肺结节组(n=26)和肺癌组(n=94)，肺癌组又分为肺腺癌组(n=38)和肺鳞癌组(n=56)。肺结节组男19例，女17例，年龄65～76岁，平均(67.14 ± 7.81)岁，其中患有肺部基础性疾病者共17例(主要包括慢性支气管炎3例、COPD 4例、慢性支气管炎合并COPD 5例、慢性支气管炎合并肺气肿3例和陈旧性肺结核2例)；肺腺癌组男23例，女15例，年龄66～79岁，平均(67.34 ± 9.59)岁，临床分期(第八版临床肺癌分期)为Ⅰ期的病人共12例，Ⅱ期及以上病人共26例，其中患有肺部慢性疾病的病人共7例(主要包括慢性支气管炎1例、COPD 1例、肺气肿2例、陈旧性肺结核1例、慢性支气管炎合并肺气肿1例和慢性支气管炎合并COPD 1例)。肺鳞癌组男47例，女9例，年龄69 ～79岁，平均(68.63 ± 7.24)岁，临床分期为Ⅰ期病人共13例，Ⅲ期病人共27例，Ⅳ期病人共16例，其中患有肺部慢性疾病的病人25例(主要包括慢性支气管炎3例、COPD 6例、肺气肿5例、陈旧性肺结核3例、慢性支气管炎合并肺气肿5例和慢性支气管炎合并COPD 3例)。3组病人一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 归类富集相关病例：按照上述研究对象的筛选标准，利用医院医疗数据库，通过相关代码归类富集相关病例，如肺结节(代码：R91.X04)，肺腺癌(代码：C34.908)，肺鳞癌(代码：C34.907)，一般细菌涂片(编码：250501001)和细菌真菌培养、鉴定(编码：250501009-b)。其中，一般细菌涂片带有白细胞和上皮细胞检测的为痰液检查，其他的为肺泡灌洗液检查。

1.2.2 涂片检查：痰液、肺泡灌洗液的一般涂片检查：首先，取病人适量的肺泡灌洗液600～1000 r/min 离心10～20 min，取离心沉淀物进行革兰氏染色质量评估，剩余肺泡灌洗液于1500～1800 r/min离心15～20 min，用接种环蘸取离心沉淀物，在玻片中央均匀地涂布成薄层。对于病人痰液，利用接种环直接蘸取后涂布于玻片中央。玻片自然干燥后，置于酒精灯火焰上方加热固定，进行常规革兰氏染色和抗酸染色。

1.2.3 观察指标：记录3组病人的痰液和肺泡灌洗液中一般细菌涂片的革兰氏阳性菌(G+)、G-、抗酸杆菌和真菌的相对数量，同时记录痰液中主要的微生物培养情况。

1.3 统计学方法 所有数据通过SPSS 22.0软件处理，计数资料以频数和百分比表示，组间比较行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺结节和肺癌病人的痰液中主要病原菌菌群比较 肺结节病人在少量G-、少量G+和大量G+检出率上与肺癌病人比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 肺结节和肺腺癌病人的痰液中主要病原菌菌群比较 肺结节病人中大量G+的检出率更高(P<0.05)；肺腺癌病人中大量G-的检出率更高(P<0.05)。见表1。

2.3 肺结节和肺鳞癌病人的痰液中主要病原菌菌群比较 肺结节病人痰液中少量G-、大量G+病原菌菌群检出率显著高于肺鳞癌病人(P<0.01)；肺鳞癌病人中少量G+病原菌菌群检出率更高(P<0.05)。见表1。

表1 病人痰液中主要病原菌的诊断结果比较(n,%)

2.4 肺结节和肺癌病人的痰液中主要微生物培养结果比较 26例肺结节病人的痰液中，共有2例(7.69%)病人培养出白色假丝酵母菌；肺腺癌和肺鳞癌病人中分别有16例(42.11%)和8例(14.2%)培养出微生物。见表2。

表2 老年肺癌与肺结节病人痰液中主要微生物培养结果(n,%)

2.5 肺结节和肺癌病人的肺泡灌洗液细菌检出率比较 肺泡灌洗液一般细菌涂片结果表明，病原菌在肺结节、肺腺癌、肺鳞癌和肺癌(包含肺腺癌和肺鳞癌)病人中的检出率分别为11.54%、34.21%、33.90%和34.05%，肺癌病人的肺泡灌洗液一般细菌涂片的细菌检出率显著高于肺结节病人(P<0.05)。见图1。

图1 肺泡灌洗液一般细菌涂片检测细菌检出率

3 讨论

肺癌的发生发展非常隐蔽，很多病人在早期并无不适症状[6]。肺癌的筛查主要借助于胸部低剂量螺旋CT，其特殊的肺部影像学特征可以快速判断肺部肿瘤的良恶性[7]。但是，部分肺癌病人的CT影像学特征与肺结节相似，特别是早期肺癌病人有相当一部分表现为肺结节，需要穿刺等有创诊断来协助确诊[8-9]。有创活检是肺癌诊断的金标准，但是针对老年病人身体健康状况、活检取材位置和检测周期较长等影响，一般老年肺结节病人很难接受这种检查。随着低剂量螺旋CT检查在常规体检中的普及，肺结节病人快速增加，而肺结节病人中有30%～40%最终发展为恶性肺结节[10]。目前的研究表明，每年进行1次低剂量螺旋 CT 不会对人体产生明显的伤害。但是，低剂量螺旋 CT在肺癌筛查方面只有不到 30 年的历史，且部分研究表明，低剂量螺旋CT会对血液细胞产生短暂的 DNA损伤[11]。更重要的是，尽管肺结节和肺癌的CT影像学特征显著不同，但是部分病例仍无法通过影像学确诊。因此，临床上急需一种快捷无创的方法辅助辨别肺结节良恶性。新近研究表明，痰液和肺泡灌洗液中的微生物生态系统对肺癌的预测和诊断具有重要意义[1]。

本研究结果显示，老年肺结节和肺癌病人在痰液和肺泡灌洗液的一般细菌涂片检查结果上存在显著性差异。在痰液的一般细菌涂片检查中，肺结节病人在少量G-和大量G+检出率显著高于肺癌病人，而少量G+检出率显著低于肺癌病人，差异有统计学意义(P<0.05)，表明一般痰液涂片检查具有辨别肺结节良恶性的潜力。当肺结节病人与肺鳞癌病人进一步比较时，其结果与肺癌病人一致。但是，肺腺癌病人与肺结节病人比较时，大量G-和大量G+检出率差异有统计学意义，而少量G-和少量G+检出率没有差异。进一步的痰液细菌真菌培养结果表明，肺腺癌和肺鳞癌病人共培养出了7种不同的微生物，而肺结节病人仅培养出了白色假丝酵母菌。肺腺癌病人痰液中的微生物具有不同于一般肺癌病人的特征，事实上，痰液、肺泡灌洗液和胸腔积液涂片细胞学检查和痰液细胞DNA倍体定量分析等技术已经在肺癌诊断中被广泛使用[12]。但是，这些检测技术主要依赖于肺癌脱落的细胞，而中央型肺癌以及早期肺癌很难有脱落细胞被检出。伴随着人体微生物组学和测序技术的进步，痰液及肺泡灌洗液的16s测序已经在肺癌的早期诊断和良恶性辨别上显示出重要的应用价值[13-14]。但是，人体微生物组学的研究结果具有较强的地域性，很难被推广应用。更重要的是，这些研究结果只是证明了某些菌属的种类或者丰度与肺癌的发生发展有密切关系，并没有形成具有临床价值的检测产品。同时，临床上的16s测序更多地用于肺部病原菌的确定，成本较高，周期较长。本研究基于痰液和肺泡灌洗的微生物病原菌，通过一般细菌涂片探究肺结节和肺癌病人的差异，具有比细胞学检测可靠，比16s测序更简便快捷的特点。

综上所述，本研究证明了痰液和肺泡灌洗液的一般细菌涂片检查和细菌真菌培养具有辨别老年肺结节良恶性的作用，这种检查方法具有简便、快速和经济的特点，同时可以减少低剂量螺旋CT对老年病人的辐射伤害，具有重要的临床应用价值。