归脾丸对小鼠抑郁行为及单胺递质的影响*

韦宇婷，钟 静，钟振国，梁明坤

1 广西中医药大学，广西 南宁 530001；2 广西中医药大学附属瑞康医院

归脾汤是治疗心脾两虚的经典名方，出自宋代严用和《济生方》，由党参、白术、当归、茯苓、黄芪、远志、龙眼肉、酸枣仁、木香、炙甘草、生姜、大枣等12 味中药组成，具有益气补血，健脾安神功效，可用于神经衰弱、失眠、头晕等症，对抑郁症社会认知、社会交往、抑郁焦虑及失眠等有改善作用［1-2］。归脾丸（浓缩丸）是归脾汤的成方剂型之一，其具体抗抑郁作用和机制尚不明确。本研究旨在观察归脾丸对抑郁模型小鼠血浆5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去 甲 肾 上 腺 素(norepinephrine，NE)、多巴胺（dopamine,DA)含量及行为学、体温、眼睑下垂的影响，探讨归脾丸的抗抑郁作用。

1 材料与方法

1.1 动物雄性SPF 级ICR 小鼠，7～8周龄，体质量20～22g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002。饲养温度（24±1）℃，12 h 人工循环光照（光照期8∶00～20∶00），自由摄食饮水。实验前适应性饲养1 周。每只动物仅用于一个单一的实验并按实验动物使用3R原则给予人道主义关怀。

1.2 仪器ANY-maze型动物行为分析系统（美国Stoelting 公司）；M200PRO 型连续波长检测仪（INFINITE）；KD3311型医用电子体温计（北京康祝医疗器械有限公司）；自制全透明强迫游泳圆筒及悬尾实验、旷场实验检测箱。

1.3 药品与试剂归脾丸（仲景宛西制药股份有限公司，国药准字Z41021897）；盐酸氯米帕明（江苏恩华药业股份有限公司，国药准字H32022974）；利血平注射液（天津金耀药业有限公司，国药准字H12020905）；小鼠5-HT 酶联免疫分析试剂盒（上海将来实业股份有限公司，货号：JL12087）；小鼠NE 酶联免疫试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：C0129030154）；小鼠DA 酶联免疫试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：C0129050156）。

1.4 方法

1.4.1 利血平拮抗实验［3］将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组（盐酸氯米帕明40 mg/kg）及 归 脾 丸 高（2.73g/kg）、中（1.65g/kg）、低（0.6825 g/kg）剂量组，每组10 只，均按20 mL/kg灌胃给药。每日1次，连续给药7天，空白组、模型组给予等量0.9%NaCl 溶液。末次给药前测小鼠基础肛温，将电子体温计探头经甘油润滑后插入小鼠肛内约1.5 cm处测量，除空白组外，其余各组按2 mg/kg腹腔注射利血平，同时灌胃药物或生理盐水，空白组腹腔注射等量0.9%NaCl 溶液［4］。注射利血平4 h 后，用温度计测量小鼠肛温；观察各组小鼠眼睑闭合状况：完全开眼0 分，1/4 闭眼1分，1/2闭眼2分，3/4闭眼3分，完全闭眼4分。

1.4.2 强迫游泳实验（forced swimming test，FST）［5］小鼠具体分组及给药方式、剂量、时间同“1.4.1”项，于末次给药1 h 后，将小鼠放于直径25 cm，高40 cm 的透明圆柱形玻璃缸中，缸内水深15 cm，水温（24±1）℃。小鼠在水中停止挣扎，仅有微小肢体运动以保持头部浮在水面，即表现出绝望状态，则视为小鼠FST 不动时间。从小鼠入水后共计时6 min，其中适应2 min，记录后4 min内累计不动时间（s）。

1.4.3 悬 尾 实 验（tail suspension test，TST）［6］小鼠具体分组及给药方式、剂量、时间同“1.4.1”项，于末次给药1 h后，用胶布将小鼠尾部1 cm处粘挂于悬尾箱内，使其呈倒悬状态，小鼠头部距离地面30 cm，小鼠为了克服倒悬异常体位而挣扎，但挣扎一段时间后出现间断性不动，即表现出失望状态，小鼠停止挣扎或无任何活动的时间视为小鼠TST不动时间。用摄像设备记录，小鼠放入悬尾箱内共6 min，其中适应2 min，记录后4 min累计不动时间（s）。

1.4.4 旷场实验（open field test，OFT）［7］小鼠具体分组及给药方式、剂量、时间同“1.4.1”项，于末次给药1 h 后，将小鼠放入敞箱，敞箱装置为长宽各60 cm，高25 cm，底面划一个30 cm×30 cm 等边方格木箱，使其与外框组成“回”字形方格，内面用黑漆涂满。将小鼠从边缘放入装置内，用摄像设备观察小鼠共7 min，其中适应2 min，记录后5 min内总运动距离及穿越至中心方格次数（四爪均进入方格方可计数），用75%酒精、1%次氯酸钠彻底清洁敞箱后再观察下一只小鼠。

1.4.5 单胺类神经递质含量测定最末次行为实验结束后，立即麻醉，心脏采血0.5～1.0 mL，放入有EDTA抗凝剂的离心管内，室温下静置30 min，4℃离心半径10 cm，3000 r/min 离心15 min 后，取上清液，-80℃保存待测实验小鼠血浆单胺递质含量。

1.5 统计学方法应用SPSS 19.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体温和眼睑下垂情况与空白组比较，模型组小鼠体温急剧下降，小鼠完全闭眼，提示利血平诱发小鼠体温下降及眼睑下垂成功。与模型组比较，归脾丸高、中、低剂量组可对抗小鼠腹腔注射利血平所引起的体温下降（P＜0.001）及眼睑下垂（P＜0.05，P＜0.01），说明归脾丸具有抗利血平作用。见表1。

表1 各组小鼠体温及眼睑下垂情况比较（±s）

表1 各组小鼠体温及眼睑下垂情况比较（±s）

注：与空白组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01，###表示P＜0.001；与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001（下同）

组别空白组模型组阳性药组归脾丸高剂量组归脾丸中剂量组归脾丸低剂量组鼠数10 10 10 10 10 10剂量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825体温（℃）37.8±0.6 32.1±0.6###35.5±0.6***36.8±0.5***36.1±0.8***35.6±0.7***眼睑下垂评分（分）0 3.5±0.8###1.7±1.0**2.0±0.6**2.2±0.4*2.3±0.5*

2.2 小鼠FST 情况与空白组比较，模型组强迫游泳不动时间增加，差异有统计学意义（P＜0.01），提示抑郁造模成功。与模型组比较，阳性药组和归脾丸高剂量组均可缩短小鼠强迫游泳不动时间，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。提示归脾丸高剂量具有拮抗小鼠获得性绝望行为的作用。见表2。

表2 各组小鼠强迫游泳不动时间比较（±s）

表2 各组小鼠强迫游泳不动时间比较（±s）

组别空白组模型组阳性药组归脾丸高剂量组归脾丸中剂量组归脾丸低剂量组鼠数10 10 10 10 10 10剂量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825不动时间（s）14.9±11.0 107.9±41.6##50.5±38.4*33.0±5.9**81.5±36.0 79.3±64.9

2.3 小鼠TST 情况与空白组比较，模型组悬尾不动时间增加，差异有统计学意义（P＜0.01），提示抑郁造模成功。与模型组比较，阳性药盐酸氯米帕明可缩短小鼠悬尾不动时间，差异有统计学意义（P＜0.01）。归脾丸各剂量组与模型组比较差异均无统计学意义。见表3。

表3 各组小鼠悬尾不动时间比较（±s）

表3 各组小鼠悬尾不动时间比较（±s）

组别空白组模型组阳性药组归脾丸高剂量组归脾丸中剂量组归脾丸低剂量组鼠数10 10 10 10 10 10剂量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825不动时间（s）59.3±10.0 139.5±49.6##52.7±36.7**114.9±27.9 98.8±44.1 110.3±35.6

2.4 小鼠OFT 情况与模型组比较，阳性药盐酸氯米帕明组5 min内总运动距离增加，差异有统计学意义（P＜0.001）。归脾丸高剂量组5 min 内总运动距离增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组小鼠5 min 内进入中心方格次数为（1.5±2.3）次，与各给药组相比差异均无统计学意义。见表4。

表4 各组小鼠总运动距离及进入中心方格次数比较（±s）

表4 各组小鼠总运动距离及进入中心方格次数比较（±s）

组别空白组模型组阳性药组归脾丸高剂量组归脾丸中剂量组归脾丸低剂量组鼠数10 10 10 10 10 10剂量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825总运动距离（m）19.2±5.3 2.8±3.3###19.5±6.9***25.8±20.9*19.3±24.0 13.0±14.3进入中心方格次数（次）15.3±5.8 1.5±2.3###2.8±2.9 4.2±3.0 2.6±3.7 2.3±2.7

2.5 小鼠血浆单胺类神经递质含量与空白组比较，模型组小鼠血浆5-HT、NE、DA 含量下降，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），造模成功。与模型组比较，阳性药盐酸氯米帕明和归脾丸高、中、低剂量均能提高小鼠血浆NE、DA 含量，差异有统计学意义（P＜0.05）；高剂量组能提高5-HT 含量，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表5。

表5 各组小鼠血浆单胺递质含量比较（±s）

表5 各组小鼠血浆单胺递质含量比较（±s）

组别空白组模型组阳性药组归脾丸高剂量组归脾丸中剂量组归脾丸低剂量组鼠数10 10 10 10 10 10剂量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825 5-HT（ng/mL）549.3±67.4 227.9±41.6##401.5±59.7**438.1±64.9**288.6±90.0 246.4±58.8 NE（pg/mL）30.67±6.1 12.67±5.5#39.26±7.1***38.87±8.1***20.88±19.8*29.28±15.8**DA（pg/mL）94.97±63.2 31.51±13.4#51.41±24.9*87.61±38.2***62.36±28.1*44.66±13.1*

3 讨论

抑郁症是多方因素综合引发的情感性病症，发病机制复杂。通过破坏机体与情绪有关的神经环路影响5-HT、NE 和DA 神经元及其通路，导致单胺递质水平降低，可使机体功能紊乱而引起抑郁［8］。中医学对抑郁症的认识较早，对本病的描述内容散见于郁证、百合病等疾病中。中医认为引发抑郁症的原因主要是肝气郁结、心脾两虚、气血肝肾不足等。中医“郁证”以心情抑郁，痛无定处，纳呆少寐，或急躁易怒，或多疑易惊为主要临床表现［9］。齐元玲等［10］对抑郁症中医证候学临床流行病学调查发现心脾两虚证在6 种常见中医证候中排第二位，占15.0%。徐春燕等［11］研究发现心脾两虚是抑郁症常见中医证候之一，占10.7%。孙志高等［12］调查了906 例抑郁症患者，发现心脾两虚占14.2%。归脾汤具有益气补血、健脾养心功效，主治心脾两虚证，被广泛应用于健忘失眠、体倦食少、盗汗、便血等疾病。以往研究证明，归脾汤具有改善模型动物认知、记忆力及增强神经细胞增殖的作用［13］，同时，归脾汤的安全性已经过临床实践验证，大、小鼠体内的急性毒性和遗传毒性实验研究也证明归脾汤的安全性，无遗传毒性影响［14］。目前，临床尚未研制出一种治疗抑郁症的理想药物。归脾汤等传统复方中药用于治疗本病疗效较好［15］。研究表明，归脾汤能提高抑郁模型动物脑内BDNF、5-HT、NE、DA 等神经递质水平［9，13］，但归脾丸抗抑郁机制是否与归脾汤一致未见相关文献报道。单胺递质不足是抑郁症发病的重要因素之一。单胺递质不足易引发脑内神经细胞病变，破坏脑内神经元及其传导通路，使中枢神经系统对情感活动有调控作用的递质降低［16］。本研究结果显示：抑郁小鼠血浆中5-HT、NE、DA 水平较空白组降低，提示抑郁症的发病机制可能与单胺递质神经元及其通路被破坏有关。归脾丸干预后抑郁小鼠血浆5-HT、NE、DA 水平较模型组升高，提示血浆中5-HT、NE、DA 的改变可能参与了抑郁行为的改善，推测归脾丸可能促进了单胺递质合成，从而发挥抗抑郁作用。

利血平诱发的抑郁症动物模型被广泛应用于抗抑郁药物的筛选和评价［17］。利血平是一种囊泡再摄取抑制剂，易被单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）降解，使单胺递质（5-HT、NE、DA）耗竭，妨碍交感神经冲动传递，从而引起行为和生理的变化。给予利血平后小鼠即出现体温下降、眼睑下垂等症状［18］。本实验以体温下降和眼睑下垂为考察指标，结果显示归脾丸高、中、低剂量均具有改善抑郁小鼠体温下降的作用，同时对利血平引起的眼睑下垂有一定改善作用。

小鼠FST、TST和OFT均为行为绝望实验，该状态与人类抑郁症发病时的生理病症相似，故而此3 种模型可作为研究抑郁症的主要模型［4］。归脾丸具有改善利血平诱导的抑郁症模型小鼠体温下降和眼睑下垂的作用，且能缩短小鼠强迫游泳不动时间，增加旷场总运动距离，提示归脾丸具有较好的抗抑郁作用。归脾丸中、低剂量对小鼠强迫游泳不动时间无影响，而高剂量组表现出明显差异。提示归脾丸抗抑郁作用存在量效关系，归脾丸剂量越大，抗抑郁效果越好，但不同个体之间也存在差异。归脾丸高、中、低剂量对小鼠悬尾不动时间均无影响。归脾丸高剂量组能增加小鼠OFT总运动距离，但对小鼠进入中心方格次数无影响，可能由于利血平化较严重及中心方格距离太远。提示归脾丸高剂量有良好的改善抑郁症症状的效果。

综上所述，本实验结果表明归脾丸对抑郁症有较好的改善作用，表现出与归脾汤［12］相似的抗抑郁作用，其中高剂量抗抑郁效果较好，提示归脾丸具有剂量方向性特点，但最佳剂量确定还需进一步研究。其中，归脾丸对利血平所致抑郁小鼠体温下降及眼睑下垂具有拮抗作用，能提高抑郁小鼠血浆5-HT、NE、DA 含量，表明其作用机制可能与增加血浆单胺递质含量有关。