基于SARS-CoV-2 关键蛋白ACE2 探索“葛根-柴胡”治疗COVID-19 的潜在机制

张维芯，周 青，戴国梁，邹建东，寇建秋

江苏省中医院，江苏 南京 210029

世界卫生组织对此次新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情在全球的风险评估为：非常高。通过全基因组比对，郝沛等［1］发现，SARS-CoV-2是通过S-蛋白与人血管紧张素转化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）互作的分子机制感染人呼吸道上皮细胞。JAMES DIAZ［2］也证明 了ACE2 通过SARS-CoV-2 进入宿主细胞的表面受体，是病毒能否成功感染的关键因子。

目前，中草药凭借其“多有效成分-多作用靶点-多信号通路”的特性较西药的“直线-单靶点”特性，在多种病毒性疾病的治疗中占有一定优势。本研究以SARS-CoV-2 感染过程关键靶蛋白ACE2为靶点，通过网络药理学方法进行中药及其单体化合物的筛选；并从主治症候群、配伍角度，多层次、多角度探讨中草药治疗COVID-19 的相关机制及潜在可能性，希望为后期药物研发及COVID-19的治疗提供思路。

1 资料与方法

1.1 ACE2 三维结构确定与疾病相关蛋白分子作用构建基于建勋课题组解析SARS-CoV-2 S 蛋白RBD 端与人细胞受体ACE2 蛋白复合体2.5 分辨率晶体结构、青岛海洋科学与技术试点国家实验室（http://ncovtarget.qnlm.ac/web/mg/hm）提供的COVID-19 药物靶标结构信息共享平台系统，以及美国国立卫生研究院（NIH）和德州大学奥斯汀分校（UT Austin）研究成果，构建ACE2 三维结构（图1）［3-4］。将其带入在线网站String 11.0（https//string-db.org），分别从生物化学、信号转导和遗传网络角度研究ACE2 蛋白与疾病相关蛋白分子间的关系。

图1 ACE2三维结构

1.2 “葛根-柴胡”作用靶点获取

1.2.1 “葛根-柴胡”活性成分及靶标蛋白筛选借助中药系统药理学分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以“ACE2”为关键词，搜索作用于ACE2的中草药及活性成分（图2）。结合COVID-19的临床特征［5］——发热，选择具有解肌退热、和解少阳的“葛根-柴胡”作为潜在药物。以口服生物利用度（OB）≥24%，生物活性分子的类药性（DL）≥0.20 作为“柴胡-葛根”活性成分筛选标准，并得到相关标靶蛋白。

图2 作用于ACE2的中草药及其活性成分

1.2.2 “葛根-柴胡”活性成分-靶标蛋白网络可视化构建借助Uniprot（https://www.uniprot.org）、PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）和GeneCards（https://www.genecards.org/）在线数据库，根据活性成分和靶标蛋白的中心度值（Betweenness Centrality）、亲中心度（Closeness Centrality）、度值（degree）查询“葛根-柴胡”活性成分靶标蛋白对应基因名，使用Cytoscape 3.7.2（http://www.cytoscape.org/）软件构建活性成分-靶标蛋白网络，进行“葛根-柴胡”活性成分-靶标蛋白网络可视化构建。

1.2.3 “葛根-柴胡”活性成分靶点通路可视化分析将“葛根-柴胡”活性成分作用靶点导入DAVID 6.7（https://david.ncifcrf.gov/）数据库，通过输入靶基因名称列表并限定物种为人，将所有靶基因名称校正为官方名称（official gene symbol），进行GO（Gene Ontology）生物学过程富集分析；设定阈值P＜0.05，进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路富集分析；使用在线绘图网站Omishare Tools（http://www.omicshare.com/tools/index.php/）将结果可视化。

1.2.4 “葛根-柴胡”活性成分-ACE2 靶点分子对接依据青岛海洋科学与技术试点国家实验室共享的COVID-19 药物靶标，选取其中Spike-RBD，ACE2 蛋白和Mpro 蛋白，采用Swiss-Model 同源模建方法，经力场限制性优化后的分子结构，将“葛根-柴胡”活性成分的分子结构导入Chem3D 获取其3D 结构，进行去氢离子化并使其能量最小化。使用Ledock（http://www.lephar.com/）进行小分子与蛋白对接，取打分最高的构想运用PyMOL 2.3.0分析并作图。

1.3 “葛根-柴胡”临床数据筛选参考《中医方剂大辞典》，检索以“葛根”“柴胡”为君药治疗外感、温病、瘟疫的中医方剂，建立方剂数据库，运用SPSS Modeler 14.1 网络模型，统计上述方剂主治的临床证候及中草药配伍关系。

2 结果

2.1 “葛根-柴胡”活性成分通过TCMSP检索到“葛根-柴胡”活性成分367个，其中18个来自葛根，349个来自柴胡。以OB≥24%、DL≥0.20筛选出活性成分28个，其中5个来源葛根，23个来源柴胡。见表1。

表1 “葛根-柴胡”活性成分基本信息

2.2 “葛根-柴胡”活性成分-靶点互作网络“葛根-柴胡”活性成分-靶点网络共包含270个节点（19个化合物节点、251个靶点节点）和527条边，平均每个活性成分与27.7个靶点相互作用，每个靶点平均与2.1个活性成分相互作用；其中52.6%的活性成分作用靶点≥12个，其中靶点≥30个的活性成分有7个，排名前5 位的活性成分分别是槲皮素quercetin MOL000098、葛根素puerarin MOL012297、山柰酚kaempferol MOL000422、芒柄花黄素formononetin MOL000392、β-谷甾醇beta-sitosterol MOL000358，分别能与147、103、60、37、36个靶点蛋白发生相互作用；从靶点角度，排名前5位的是PTGS2、PPARG、PTGS1、AR、NOS2，分别能与11、10、10、9、9个化合物发生相互作用。方形代表葛根中化合物，六边形代表柴胡中化合物，圆形代表靶点，每条边表示活性成分与靶点之间的相互作用关系。见图3。

图3 葛根-柴胡药对中化合物-靶点网络

2.3 “葛根-柴胡”活性成分与ACE2蛋白的核心网络(PPICN)构建将ACE2带入String 11.0进行分析，得出ACE2的PPICN，得到ACE2的直接/间接作用蛋白共11个。通过在线韦恩图求得“葛根-柴胡”活性成分作用靶点与ACE2的交集基因共3个，分别为DPP4、ACE2、AGTR1。见图4—5、表2。

表2 “葛根-柴胡”活性成分与ACE2直接/间接作用蛋白的交集基因

图4 ACE2蛋白相互作用核心网络（PPICN）

2.4 “葛根-柴胡”活性成分靶点通路分析DAVID中GO功能富集分析得到GO条目2097个（P＜0.05），其中生物过程（BP）条目1684个，细胞组成（CC）条目116个，分子功能（MF）条目297个，生物过程、细胞成分和分子功能分别占80.31%、14.16%和5.53%。KEGG通路富集筛选得到25条信号通路（P＜0.05），涉及非小细胞肺癌和小细胞肺癌信号通路等，其中非小细胞肺癌通路涉及PRKCA-E2F1-EGFR-PIK3CGE2F2-RXRA-ERBB2-TP53-AF1-RB1-BAD-PRKCB-AKT1-MAPK1-CCND1-CASP9-RASSF1-EGF；小细胞肺癌通路涉及E2F1-PIK3CG-E2F2-PTGS2-RXRA-RELA-TP53-NFKBIA-RB1-BCL2L1-CDK2-AKT1-CCND1-CDKN1BCASP9-BCL2-NOS2-IKBKB-MYC-CHUK（图6—7）。

图6 “葛根-柴胡”活性成分作用靶点KEGG富集分析

图5 与ACE2直接/间接作用蛋白的交集基因

图7 “葛根-柴胡”活性成分靶标GO富集分析

2.5 “葛根-柴胡”活性成分与Spike-RBD、ACE2和Mpro分子对接结果将“葛根-柴胡”排名前5位的化合物槲皮素、葛根素、山奈酚、芒柄花黄素和β-谷甾醇化合物离子化单体与Spike-RBD、ACE2和Mpro进行分子对接，结果显示葛根素与Spike-RBD、ACE2的结合性最好，槲皮素与Mpro的结合性最好。见表3及图8—9。

图8 槲皮素、葛根素、山柰酚、芒柄花黄素和β-谷甾醇化合物离子化

表3 槲皮素、葛根素、山柰酚、芒柄花黄素和β-谷甾醇作用于Spike-RBD、ACE2和Mpro的结合效能

图9 “葛根-柴胡”活性成分与Spike-RBD、ACE2和Mpro的分子对接结果

2.6 “葛根-柴胡”方剂数据挖掘结果共收录“葛根”“柴胡”治疗外感、温病、瘟疫、疫病的方剂110首，涉及方书44本，其临床症候包括恶寒、发热、骨节疼痛、心烦、口渴、项强等，恶寒、头痛、身热频次最高；临床配伍中，与“葛根-柴胡”配伍频次最高的其他药物为生石膏、黄芩、知母、甘草。见表4及图10—11。

图10 “葛根-柴胡”主治症候群

表4 “葛根-柴胡”方剂涉及方书基本信息

图11 “葛根-柴胡”药物核心配伍

3 讨论

疫病是指感受疫疠之气造成的一时一地大规模流行的急性传染病总称，又称瘟疫［6］。东汉时期张仲景在《伤寒杂病论》自序中称：“余宗族素多，向余二百，建安纪年以来犹未十稔，其死亡者，三分有二，伤寒十居其七。”从70%的死亡率看，疫病流行在当时相当猖獗。元代王履《医经溯洄集》中指出［7］，瘟疫，乃感天地恶毒异气；治疗原则吸取刘河间清热泻火思想，主张温病“治以辛凉占寒”，其疾病的转机为“热自内达外”。明代龚廷贤《寿世保元》中云：“瘟疫之病，皆是大热之症，不町妄用热药。”［8］明代吴又可《温疫论》中指出［9］：“夫瘟疫之为病，非风、非寒、非暑、非湿，乃天地间别有一种异气所感。”强调需进行病因治疗，提出了“一病只须一药之治”的设想，为传染病的专病专治开创了思路。COVID-19 属中医“疫病”范畴［10-12］，其主症为：发热、乏力、咳嗽；病位在半表半里之间；对于以发热为主症的，国医大师熊继柏推荐轻清宣透疗法，如小柴胡汤或者小柴胡汤合桑菊饮。

最新基础研究数据表明，ACE2 是COVID-19 病毒S 蛋白的细胞受体；COVID-19 的S 蛋白可能通过结合细胞受体ACE2 引导病毒进入宿主细胞，且冠状病毒RBD 端与ACE2 的结合亲和力越高，病毒的感染性和致病性越强。SARS-CoV-2 感染患者出现多脏器损伤，推测其机制可能为SARS-CoV-2结合ACE2，下调ACE2 的表达，使ACE-Ang Ⅱ轴和ACE2-Ang-（1-7）轴平衡失调，促炎因子表达升高，诱发炎症风暴，导致全身炎症反应［13］。据中国中医研究院吴文清对中国疫病的统计［14］，从西汉到清末，中国至少发生过321 次大型瘟疫，在有限的时间和区域内，中医药一次又一次与各种疫病展开了生死对决，并控制了疫情蔓延。TANG S 等［15］在Lancet 杂志上发表文章指出，中医药在控制疫情大规模爆发方面具有重要作用。

本研究基于青岛海洋科学与技术试点国家实验室提供的COVID-19 药物靶标信息，针对SARSCoV-2感染过程关键靶蛋白ACE2进行中草药及其有效活性成分的筛选，并基于中医经典医籍，分别从网络药理学、经典医籍方面，多层次、多维度对“葛根-柴胡”治疗COVID-19 进行了探索性研究。网络药理学研究显示，“葛根-柴胡”药对较高的活性成分均可作用于ACE2，分子对接结果显示槲皮素、葛根素与ACE2 的结合能力高于洛匹那韦和利托那韦，同时槲皮素、葛根素、山柰酚与Mpro 结合能力也高于洛匹那韦和利托那韦。通过对经典医籍的数据整理，我们可以看出“葛根-柴胡”治疗外感、温病、疫病的最主要症候为：恶寒、身热、头痛。溯源文献，明代《本草正》［16］：葛根，其性凉散，其气轻，善达诸阳经，且以阳明为最，善解表发汗，善解温热时行疫疾，凡热而兼渴者，此为最良，当以为君，而佐以柴。《本草正》：柴胡，其性凉，其性散，味微苦，属足少阳胆经药，治寒热往来，疗疟疾，除潮热，为和解要剂。“葛根-柴胡”药对具有确切的解肌退热、和解少阳功效，与目前报道的SARS-CoV-2 临床症状较为吻合，具有潜在的治疗COVID-19功效，为深层次探索中医药治疗COVID-19 提供了依据。