蒲公英水提液不同萃取部位对人骨肉瘤MG-63 细胞的影响*

徐世红，柳 博，谢兴文，李鼎鹏，许 伟，丁聚贤，黄 睿，姜朝阳

1 甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050；2 甘肃省中医院；3 甘肃中医药大学；4 甘肃省第二人民医院

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）起源于骨形成的原始间充质细胞，是一种罕见但极具破坏性的疾病。OS 的发病率呈明显的双峰特征即发病多集中在青少年时期和60 岁以上的老年时期，尤其成为青少年时期危害最严重和发病率最高的恶性肿瘤，具有恶性程度高、进展快及预后差的特征［1-4］。目前临床治疗OS 主要采用新辅助化疗模式（术前化疗+外科治疗+术后化疗），将OS患者的5年生存率提高到60%～70%左右［5-6］，同时也面临着严重的胃肠道反应、骨髓抑制、内脏损害及溃疡等后遗症，并严重影响患者生存质量［7］。近年来随着中医药抗肿瘤理论和方药的不断发展，中药具有的多靶点、多通路协同作用特点，可通过多种调节途径治疗各个时期OS［8］，这种优势正在被越来越多的人所重视。

目前中药抗肿瘤的研究不断深入，蒲公英也备受关注；蒲公英是多年生草本植物，为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicumHand-Mazz、碱地蒲公英Taraxacum borealisinenseKitam或相同属种植物的干燥全草，又名“黄花地丁”“婆婆丁”等［9］，味甘、性寒，归肝、胃经，具有清热解毒、消肿散结功效［10］。现代药理学研究发现蒲公英不仅具有灭菌消炎、抗氧化的功用［11］，还具有抗肿瘤作用［12-13］，但蒲公英水提液经过不同极性溶剂萃取后直接体外干预对骨肉瘤的相关报道较少，本研究采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazdium，MTT)比色法探讨蒲公英水提液不同极性萃取部位对人骨肉瘤MG-63 细胞增殖、黏附的作用，为探索蒲公英的抗肿瘤作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器Rayto RT-6100 型酶标仪；SW-CJ-1D/2FD 型超净工作台（苏州净化设备厂）；RE-301型旋转蒸发仪（山东博科）；TD-6M 型台式低速离心机（BIOBASE）；1000 mL 分液漏斗；BT-224S 型电子天平（中国北京赛多利斯）。

1.2 试药蒲公英药材于2018 年由甘肃省中医院中药房馈赠。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂（兰州联创生物科技有限责任公司）；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑蓝（Sigma 公司）；胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所）；DMEM 培养基（Gibco 公司）；青链霉素（Hyclone 公司）。

1.3 细胞株人骨肉瘤MG-63 细胞株购于上海中国科学院医学生物研究所。

1.4 方法

1.4.1 蒲公英水提液制备称取蒲公英500 g，用纱布包裹，加入10 倍体积水浸没，浸泡30 min 后加热至沸腾，微沸30～40 min，过滤，滤液备用，药渣依法再煎煮2 次，合并滤液，离心去沉淀水浴浓缩至1000 mL备用。

1.4.2 蒲公英水提液不同萃取部位的制备将蒲公英水提液依次用石油醚0.5 g、乙酸乙酯1.5 g和正丁醇4.5 g，水78 g，按照1∶1 比例，各1000 mL进行萃取，萃取至溶剂层无色，将萃取液和剩余水溶液用旋转蒸发仪去溶剂，制备得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相浸膏，-20℃冰箱保存备用。

1.4.3 MG-63 细胞分组实验设正常组（正常培养基）、对照组（3%乙醇培养基）和实验组。正常组：将200 μL MG-63 单细胞悬液接种于96 孔板中，正常培养。对照组：将200 μL MG-63单细胞悬液接种于96 孔板中，培养24 h 后，弃去旧的正常培养液，加入含3%乙醇的完全培养基，继续孵育24、48、72 h后检测细胞存活率。实验组：将200 μL MG-63单细胞悬液接种于96孔板中，培养24 h后，弃去旧的正常培养液，加入含3%乙醇的培养基溶解的不同浓度（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 μg/μL）乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚萃取部位浸膏，各组均设5 个复孔，用MTT 法测定细胞增殖情况，再用Graphpad Prism 7 分别计算蒲公英水提液不同萃取部位24、48、72 h 的半抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）值，所有实验重复3次。见表1。

1.4.4 MG-63细胞形态学观察和细胞增殖检测胰蛋白酶消化对数生长期的人骨肉瘤MG-63 细胞，调整细胞浓度以每孔1×104～1×105个接种于96孔板中，37℃、5% CO2条件下培养24 h待其充分贴壁后分组，每组设5 个复孔，每组萃取部位分别以不同浓度加入，培养24、48、72 h后取出96孔板，对各组细胞进行拍照。拍照后弃去旧培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2 次，向每孔中加入150 μL 新培养液及5 mg/mL 的MTT 20 μL。培养箱中继续培养4 h后终止培养，显微镜下可见紫色结晶生成，弃去原培养液，在每孔中加入DMSO 200 μL，于摇床上振荡10 min。待结晶溶解后，将96 孔板置于酶联免疫检测仪中，以含纯DMSO 200 μL的孔为调零孔，490 nm为检测波长测定各孔吸光度值（A）值，计算不同浓度蒲公英水提液不同极性萃取部位对人骨肉瘤MG-63细胞生长抑制情况。

2 结果

2.1 蒲公英水提液不同萃取部位对MG-63 细胞增殖的影响不同萃取部位对MG-63 细胞生长的抑制能力依次为：乙酸乙酯＞正丁醇＞水＞石油醚，其中乙酸乙酯部位对MG-63 细胞的抑制率最高；不同萃取部位分别作用于MG-63 细胞在24、48、72 h后检测，抑制率随药物浓度递增和作用时间延长而上升，表现为较好的剂量-时间药物效应关系；乙酸乙酯、正丁醇、水及石油醚最大抑制率分别为79.80%、64.09%、61.65%及60.32%，其半数抑制率（IC50）分别为0.36、0.57、1.15及1.42 μg/μL。正常组对人骨肉瘤MG-63 细胞的抑制率为0。见表1。

表1 蒲公英水提液不同萃取部位对MG-63细胞增殖的影响

2.2 蒲公英水提液不同萃取部位对MG-63细胞增殖形态学变化影响乙酸乙酯萃取部位对MG-63细胞的抑制率最高；显微镜下乙酸乙酯萃取部位分别作用24、48、72 h后MG-63细胞形态变化见图1。

图1 蒲公英水提液乙酸乙酯萃取部位对MG-63细胞形态学的影响（显微镜10×20）

由图1可见，显微镜（10×20）下正常MG-63细胞贴壁生长，细胞基本轮廓清晰，呈现梭形和多边形，可观察到细胞部分细微结构。实验组乙酸乙酯部位对肿瘤细胞作用后较其他3 组活细胞数量相对较少，部分细胞收缩变圆后凋亡；随着作用时间的延长，活细胞数逐渐减少，细胞形态逐渐扁圆后形态单一化，悬浮细胞明显增多，同时细胞碎片增加。

3 讨论

骨肉瘤作为一种临床青少年最常见的间叶组织源性恶性肿瘤，其危害巨大，且近年来由于化疗耐药性增加、新的治疗方法未规范及现代社会环境污染等问题，骨肉瘤的发病呈上升态势，其预后差、高病死率［14-15］等严重危害急需新的治疗药物及方法的开发和应用；近年来随着现代药理学在中医药领域的应用及中医药抗肿瘤理论的不断发展，中医药多靶点、多通路和低毒副作用优势［16］逐渐显现。方雪妮等［17］采用回顾性研究发现，中医药对肿瘤微环境具有明确调节作用，可发挥抑制肿瘤细胞增殖及转移等作用；相关研究发现中药复方片仔癀（由牛黄、三七、麝香、蛇胆组成）可抑制人骨肉瘤肿瘤干细胞裸鼠移植瘤的生长，且能逆转阿霉素耐药作用，其作用机制与抑制膜转运蛋白ABCB1、ABCG2 表达相关［18］。加味四物汤可通过下调荷瘤小鼠组织中的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体Flt-1、KDR 的表达，抑制肿瘤生长。同时研究发现中药单体黄芩素可通过调节Notch-1 通路和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，发挥抑制骨肉瘤的作用，具有广泛的抗肿瘤活性。

蒲公英作为一种在我国广泛分布的药食同源性植物［19］，具有悠久的药用历史［20］，随着现代药理学在中医药领域的应用和发展，发现其含有包括黄酮、多糖、萜类、植物甾醇、香豆素和有机酸等多种成分，在抗肿瘤方面具有突出疗效［21］。我们采用MTT 法对蒲公英水提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部分进行体外抗肿瘤活性研究，结果表明，各萃取部位相对MG-63 细胞有不同程度的抑制作用，并且呈现明显的剂量与时间的正向效应关系；其中乙酸乙酯部位相对MG-63 细胞的抑制率最高。蒲公英黄酮类成分中木犀草素为抗乳腺癌活性成分［22-23］。相关研究表明蒲公英乙酸乙酯萃取部位中黄酮类含量丰富［24］，本实验中乙酸乙酯萃取部位的抗肿瘤作用优于其他3 组，可能与其含有黄酮类成分较高有关；水萃取部位同样对肿瘤细胞有抑制作用，但其黄酮类成分含量较低，可能是其富含的多糖类成分起到了抑制肿瘤细胞的作用。

蒲公英水提液的不同萃取部位在体外实验中有一定抗肿瘤作用，但其中究竟是黄酮类成分、多糖类成分还是其他成分起作用，有待进一步深入研究，因此，进一步根据相关文献及本研究结果进行蒲公英黄酮类成分的提取和分析，将是下一步工作的重点。