基于MEK/ERK信号通路探究丹参酮ⅡA磺酸钠对缺氧复氧心脏微血管内皮细胞的保护作用

李静 卢峰 穆怀彬 李燕 (唐山市工人医院心内科，河北 唐山 063000)

丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)是从丹参中提取的二萜醌类化合物，具有扩张血管、改善微循环、抗炎抗氧化等药理作用，常用于治疗心脑血管疾病〔1〕。心肌缺血/再灌注损伤是指心肌组织在急性缺血后恢复血流供应时，出现损伤加重现象〔2〕，内皮缺氧/复氧(H/R)是缺血-再灌注损伤的主要后果，它可以引发氧化应激，引起多种器官组织损伤，诱导细胞凋亡和内皮功能障碍〔3〕。本实验通过建立心脏微血管内皮细胞(CMECs)H/R模型，观察STS对CMECs的保护作用与机制。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠30只，体重(180～220)g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验单位使用许可证号SCXK(鲁)20190003。

1.2主要试剂 DMEM培养基(上海吉至生化科技有限公司)；胎牛血清(FBS，广州柏赛柯生物技术有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒、β-actin单克隆抗体(上海恒斐生物科技有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)、RNaseA、碘化丙啶(PI)、胰酶、电化学(ECL)发光液(北京伊塔生物科技有限公司)；膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海经科化学科技有限公司)；酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3多克隆抗体、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)多克隆抗体(武汉亚科因生物技术有限公司)；p-促分裂原活化蛋白激酶(MEK)单克隆抗体(上海钰博生物科技有限公司)；p-细胞外信号调节激酶(ERK)1/2(上海翔升生物科技有限公司)；基质胶(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1CMECs的分离与培养 出生4 d以内的SD大鼠，全身用75%乙醇进行2次全身消毒后，仰卧位固定于超净台中的操作台上。开胸取心室肌，在37℃的条件下用眼科剪剪碎，并在0.1%的胰蛋白酶消化2～3次，每次消化5 min。随后在4℃、1 000 r/min条件下离心10 min，弃上清，内皮细胞重悬于含10% FBS DMEM培养基进行鉴定及传代培养，传代4次后用于后续实验。

1.3.2CMECs细胞H/R模型的建立及实验分组 用缺氧液润洗离体培养的细胞3次(缺氧液预先用高纯氮气饱和30 min)，根据培养皿大小换用不同体积的缺氧液，在1%O2、 5%CO2、95%N2，37℃条件下制作缺氧模型，复氧实验时立即换用正常培养基置于细胞培养箱(5%CO2、95%空气、37℃)条件下培养，制作H/R模型〔4〕。实验分组为对照组：除正常培养外不做其他处理；H/R组：构建的H/R模型细胞；低剂量STS组：除培养基外加入12.5 μg/ml STS；中剂量STS组：除培养基外加入25.0 μg/ml STS；高剂量STS组：除培养基外加入50.0 μg/ml STS。

1.3.3MTT比色法检测CMECs细胞活力 CMECs细胞以2 000个/孔的密度接种于96孔培养板，给予相应处理后，继续培养96 h后，每组做3个复孔。向每孔加入MTT 10 μl(5 mg/ml)，37℃孵育4 h后，去除培养基，并加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl。将96孔培养板置于酶标仪上读数，设置波长490 nm，记录数据〔5〕。

1.3.4流式细胞术检测细胞凋亡率 通过Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测每组细胞的凋亡率。将细胞用0.25%胰酶消化，5 min后吸出消化液，用预冷的PBS洗涤，转移至离心管，离心(1 000 r/min，5 min)后弃去上清。用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml。随后加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl PI至100 μl的细胞悬液中。在室温下避光孵育5～15 min，然后使用流式细胞仪检测，胶质瘤细胞核呈现红色荧光，即细胞呈晚期凋亡现象〔6〕〔细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数/细胞总数×100%〕。

1.3.5Western印迹 吸出细胞培养液，PBS清洗3次，6孔板每孔中加120 μl放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液，置于冰上裂解20 min，将细胞裂解物收集到离心管中，离心提取上清液，即为细胞总蛋白。蛋白经沸水变性后冷却至常温，在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束后进行转膜，使用聚偏氟乙烯(PVDF)膜恒流转膜2 h；将转膜完毕的PVDF膜取出，浸泡于5%脱脂奶粉配制的封闭液中，37℃封闭1 h后洗膜。洗膜后，分别加Bax多克隆抗体、酶切caspase-3多克隆抗体、p-MEK多克隆抗体、p-ERK2多克隆抗体，一抗稀释比例为1∶1 000，4℃孵育过夜；回收一抗，洗涤后加入适量的二抗(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h。滴加适量的ECL底物液，孵育数分钟，使用凝胶图像分析系统观察〔7〕。

1.3.6流式细胞术检测细胞周期 取处于对数生长期的细胞，用胰酶消化，消化4 min后吸出消化液，离心(1 000 r/min，5 min)后弃去上清，加入PBS轻轻吹打重悬，使用移液枪将细胞悬液转至流式管内，离心弃去上清；用PBS洗涤3次，用事先-20℃预冷的75%乙醇1 ml重悬细胞，封闭流式管口，-20℃保存过夜。加入PBS洗涤1遍，离心(1 000 r/min，5 min)后弃去上清；加入100 μl的RNaseA，37℃水浴30 min，加入400 μl的PI溶液并充分混匀，4℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测，保存数据〔8〕。

1.3.7光学显微镜下观测CMECs细胞血管形成能力 提前1 d把基质胶置于冰上4℃融化。在无菌条件下，将200 μl基质胶迅速铺到-20℃预冷的6孔板中，使基质胶均匀铺满整个板孔，确保胶完全覆盖孔底，并且无气泡，将其放入细胞培养箱中至凝固后待用。消化收集细胞，取2×105个细胞均匀接种到有基质胶的6孔板中，继续培养24 h。在光学显微镜下观察CMECs血管形成情况〔9〕。血管形成率=(血管形成后的细胞数量-血管形成前的细胞数量)/血管形成前的细胞数量×100%。

1.4统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1STS对CMECs细胞活力的影响 与对照组相比，H/R组细胞活力显著降低(P<0.05)；与H/R组比较，低、中、高剂量STS组细胞活力均显著增高，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表1。表明STS可增加H/R诱导后CMECs细胞活力。

表1 STS对CMECs细胞活力、凋亡及细胞周期的影响

2.2STS对CMECs细胞凋亡的影响 与对照组相比，H/R组细胞凋亡率、Bax、酶切caspase-3水平显著升高(P<0.05)；与H/R组比较，低、中、高剂量STS组细胞凋亡率、Bax、酶切caspase-3水平均显著降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表1、图1、图2。表明STS可抑制H/R诱导的CMECs细胞凋亡。

2.3STS对CMECs细胞周期进程的影响 与对照组比较，H/R组G0/G1期比例明显升高(P<0.05)，S期明显降低(P<0.05)，提示，细胞周期被阻滞在G0/G1期。与H/R组比较，低、中、高剂量STS组细胞G0/G1期比例依次降低，S期依次升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，G2/M期细胞数占总细胞数的百分比变化不大，表明STS处理后G0/G1期向S期转变，阻滞解除。见表1、图3。

2.4STS对CMECs细胞血管形成能力的影响 与对照组相比，H/R组管的形成显著降低(P<0.05)；与H/R组比较，低、中、高剂量STS组管的形成均显著升高，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见图4、表2。表明STS可促进H/R诱导的血管形成能力。

1～5:对照组，H/R组，低剂量STS组，中剂量STS组，高剂量STS组，图5同图1 Western印迹检测Bax、酶切caspase-3水平

图2 STS对CMECs细胞凋亡的影响

图3 STS对CMECs细胞周期的影响

图4 STS对CMECs细胞血管形成能力的影响(×200)

2.5STS对MEK/ERK信号通路相关蛋白表达的影响 与对照组相比，H/R组p-MEK、p-ERK2水平显著降低(P<0.05)；与H/R组比较，低、中、高剂量STS组p-MEK、p-ERK2水平均显著升高，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表2、图5。表明STS可通过激活MEK/ERK信号通路抑制H/R诱导的细胞凋亡和血管形成能力。

表2 STS对CMECs细胞血管形成能力及MEK/ERK 信号通路相关蛋白表达的影响

图5 STS对MEK/ERK信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

MEK/ERK信号通路是多种细胞因子调控细胞凋亡和增殖的关键，MEK/ERK信号通路是血管生成最为重要的信号转导，MEK/ERK信号通路的激活能够促进正常内皮血管的生成，改善血管内皮功能〔10〕。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中重要的成员之一。其中ERK能够被上游分子MEK的磷酸化激活，进入细胞核，作用于相应的转录因子及核蛋白，参与血管的调控，发挥调节细胞增殖、凋亡和分化等作用〔11〕。caspase-3、Bax蛋白与细胞凋亡密切相关，是介导细胞凋亡的重要调控因子，可反映细胞凋亡状态〔12〕。本研究结果提示STS使MEK/ERK信号被激活，凋亡受到抑制。这与前人研究〔13〕发现的MEK/ERK信号通路的激活可保护人CMECs免受H/R诱导的损伤一致。

细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为分裂间期与分裂期2个阶段，并严格按照G0/G1期、S期、G2期、M期的顺序进行〔14〕。ERK信号通路在血管内皮细胞增殖及新血管生成过程中发挥重要作用，持续性激活的ERK信号通路可正向调控细胞周期，推动细胞由G1期进入S期，进而促进细胞异常增殖与分化。本研究结果说明STS可以促进CMECs细胞周期进展，增强血管形成能力。

综上，STS对H/R CMECs损伤的保护作用与其激活MEK/ERK信号通路有关。