老年癫痫患者急性发作后血浆外泌体长链非编码RNA MIR155HG的检测水平及意义

韩永凯 张萍 李斯娜 李静 王旭生 张帆 杜爱玲 张留莎 宋景贵

(新乡医学院第二附属医院 1神经内科，河南 新乡 453002；2急诊科；3新乡医学院第三附属医院神经内科)

老年癫痫是指60岁或65岁以后发病的癫痫，发作时常伴有认知、精神、社会学等诸方面功能障碍，癫痫急性发作后可能会造成不可逆的脑损伤，又因患者为老年人群，因此致残率和病死率都很高〔1〕。目前临床常采用许多量表对老年癫痫患者病情及预后进行评估，但其准确性和及时性难以满足临床需求，因此，急需简便、准确评估老年癫痫患者短期预后的临床指标〔2〕。长链非编码RNA(LncRNA)MIR155HG是长度为1 500 bp的LncRNA，因其为miR-155的宿主基因而得名〔3〕。目前，已有研究表明血清外泌体中miR-155与癫痫发生有密切联系，然而未见LncRNA MIR155HG与癫痫相关性的报道〔4〕。外泌体广泛分布于血液、脑脊液等体液中，在许多生理病理过程中起着重要作用〔5〕。本研究通过检测老年癫痫患者血浆外泌体中LncRNA MIR155HG表达水平，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年5月至2019年6月因癫痫急性发作于新乡医学院第二附属医院神经内科门诊就诊、住院的159例老年癫痫患者，纳入标准：①符合癫痫诊疗指南中的诊断标准〔6〕；②病历资料齐全者；③有头颅CT或磁共振成像(MRI)等神经影像学脑电图结果者；④年龄>60岁者。排除标准：①仅有一次临床发作者；②因低血糖或肝、肾等脏器病变因素引起抽搐患者；③患脑出血、脑肿瘤等引起抽搐患者；④脑电图有痫性放电但临床发作不典型者。所有患者由主治医师明确诊断，本试验经医院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准，所有受试对象家属由专业人员详细告知研究内容并自愿参加，并签署知情同意书。根据随访期间是否发生预后不良将患者分为预后不良组(76例)和预后良好组(83例)，其中预后不良组年龄60～87岁；预后良好组年龄60～86岁。两组性别、年龄、体重指数(BMI)、吸烟史、饮酒史、文化程度、蒙特利尔认知评估(MoCA)量表评分差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

1.2主要试剂与仪器 白细胞介素(IL)-2、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号：JK-a-1494)、IL-6 ELISA试剂盒(货号：JK-a-0023)、IL-8 ELISA试剂盒(货号：JK-a-1002)、IL-1β ELISA试剂盒(货号：JK-a-1438)、肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒(货号：JK-a-0016)均购自上海晶抗生物工程有限公司；exoRNeasy serum/plasma Midi kit(货号：77044)，购自上海浩洋生物科技有限公司；miScript SYBR®Green qPCR Kit(货号：218076)，购自德国QIAGEN公司；AceQ qPCR SYBR®Green Mix(货号：Q111-02)，购自南京诺唯赞生物科技有限公司，CFX384实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)仪，购自美国Bio-Rad公司。

表1 两组一般资料比较

1.3研究方法

1.3.1样品采集及保存 抽取老年癫痫患者急性发作后24 h内清晨空腹静脉血样置于EDTA-K2抗凝真空管中，3 000 r/min离心15 min后收集血浆，置于-80℃保存待测。

1.3.2一般资料收集 查阅门诊及住院病历，收集患者一般资料，包括性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、文化程度(低：小学及以下；中：初高中；高：大学及以上)；通过MoCA量表对患者进行认知功能评估，该量表涉及8个认知领域的评估，其中包括命名、语言、注意、空间与执行功能、回忆、延迟、抽象和定向力。MoCA总分为30分，当受试者受教育年限<12年时，在测试得分的基础上加1分，校正由教育程度产生的偏倚，得分越高认知功能越好。

1.3.3qRT-PCR检测血浆外泌体LncRNA MIR-155HG水平 采用qRT-PCR检测老年癫痫患者血浆外泌体中LncRNA MIR155HG表达水平。采用exoRNeasy试剂提取血浆外泌体总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用qRT-PCR仪对LncRNA MIR155HG及其内参GAPDH进行扩增，引物序列：LncRNA MIR155HG正向：5'-TGGAACAAATTGCTGCCGTG-3'，反向5'-AGGTTGAACATCCCAGTGACC-3';GAPDH正向：5'-ATTTGGCTACAGCAACAGGGTG-3'，反向：5'-TGGTTGAGCACAGGGTACTTTATTG-3'。qRT-PCR体系共20 μl：cDNA(50 ng/μl)2 μl，miScript SYBR®Green Mix 10 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.4 μl，引物由上海生工生物公司合成。反应条件：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。每份样品均设3个重复孔，采用2-ΔΔCT法计算血浆外泌体LncRNA MIR155HG相对表达量。

1.3.4血浆细胞因子水平检测 采用ELISA检测老年癫痫患者血浆IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.5随访 患者随访1年，以其癫痫发作频率较就诊前的改变为标准判断发作的变化状况，无癫痫发作83例作为预后良好组，发作次数无减少或较前较少<50%(或患者病情未得到改善甚至加重)76例作为预后不良组。

1.4统计学方法 采用SPSS23.0软件进行t检验、χ2检验、Pearson相关分析、Logistic回归分析，采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血浆外泌体LncRNA MIR155HG水平对老年癫痫患者预后不良的预测价值。

2 结 果

2.1两组血浆外泌体LncRNA MIR155HG水平比较 预后不良组血浆外泌体中LncRNA MIR155HG水平(1.54±0.41)明显高于预后良好组(1.00±0.23，P<0.05)。

2.2两组血浆细胞因子水平比较 预后不良组血浆中IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平明显高于预后良好组(P<0.05)。见表2。

表2 两组血浆细胞因子水平比较

2.3预后不良组老年癫痫患者血浆外泌体LncRNA MIR155HG与血浆细胞因子水平相关性 预后不良组老年癫痫患者血浆外泌体LncRNA MIR155HG与血浆IL-2(r=0.486，P=0.006)、IL-6(r=0.493，P=0.005)、IL-8(r=0.508，P=0.002)、IL-1β(r=0.483，P=0.006)、TNF-α(r=0.514，P=0.001)水平呈正相关。

2.4血浆外泌体LncRNA MIR155HG水平对老年癫痫患者预后不良的预测价值 以血浆外泌体LncRNA MIR155HG水平为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，血浆外泌体LncRNA MIR155HG水平预测老年癫痫患者预后不良的曲线下面积(AUC)为0.852(95%CI:0.790～0.915)，截断值为1.171，特异性为79.5%，敏感度为85.5%。见图1。

图1 血浆外泌体LncRNA MIR155HG水平 预测老年癫痫患者预后不良的ROC曲线

2.5影响老年癫痫患者预后不良的多因素分析 将老年癫痫患者是否发生预后不良作为因变量，以血浆外泌体LncRNA MIR155HG水平及血浆IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示LncRNA MIR155HG、TNF-α是影响老年癫痫患者预后不良的独立危险因素。见表3。

表3 影响老年癫痫患者预后不良的多因素分析

3 讨 论

癫痫是诸多因素引起大脑神经元异常放电所致的短暂性脑功能失调病，可见于各年龄段，且儿童癫痫发病率高于成人〔7〕。而进入老年期后，由于老年痴呆、脑血管疾病及神经系统退行性病变增多，癫痫的发病率又随之上升〔8〕。老年人癫痫通常是指60岁以上老年人出现至少2次的痫性发作，又因老年人基础疾病较多，癫痫急性发作后易造成高致残率和死亡率，给老年癫痫患者及家庭带来沉重的心理和经济负担，同时对社会产生较多负面影响〔9,10〕。

老年人癫痫的发病机制尚未明了，但以免疫学发病机制研究较多〔11,12〕。癫痫患者存在免疫异常，且其体液中部分细胞因子的变化也处于异常状态〔13〕。外泌体是细胞产生的小于150 nm的双层膜结构囊泡，可参与包括阿尔兹海默病、帕金森病在内的多种脑部疾病的发生和发展，因此血浆外泌体的研究可能对老年癫痫有重要意义〔14〕。LncRNA可通过表观遗传修饰与转录后加工等多种机制在细胞生命活动中发挥作用，且在先天性和获得性免疫系统中，对免疫细胞的激活和分化发挥重要调节作用〔15〕。LncRNA MIR155HG是miR-155的宿主基因，LncRNA MIR155HG中包含有miR-155的前体序列，已有研究表明，miR-155在癫痫的免疫炎症机制中发挥重要作用〔16,17〕。本研究结果提示LncRNA MIR155HG与老年癫痫患者的预后有密切联系，可能作为癫痫治疗的新靶点，推测可能是LncRNA MIR155HG作为miR-155的宿主基因，同样有调节炎性血脑屏障的白细胞黏附及广泛的促炎作用，可进一步加重患者病情，影响老年癫痫患者预后，增加预后不良概率。刘丹丹等〔18〕研究表明细胞因子在癫痫发病过程中发挥重要作用，IL-2为Th细胞应激状态下分泌的一种糖蛋白，可促进淋巴细胞增生和生存，调节适应性免疫反应〔19〕；IL-6为早期炎症因子，在炎症、感染及患肿瘤过程中可能会发挥免疫作用〔13〕；IL-8由巨噬细胞产生，其水平上升可能会增加局部组织的炎症反应〔20〕；IL-1β的异常分泌通常与一些常见的自身免疫性疾病的发生有关〔21〕；TNF-α可加剧脑内炎症反应，影响神经元的兴奋性，引起疾病反复发作〔13〕。本研究结果与李超等〔22〕研究结果接近，也和李欣等〔23〕研究中血清细胞因子在癫痫患者中的表达趋势一致。推测预后不良组老年患者中各类血浆细胞因子水平上升，加剧脑内炎症反应，破坏血脑屏障，引起疾病的反复发作，造成不良预后。而本研究Pearson相关分析结果进一步表明血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平的变化可为评估老年癫痫患者病情及预后提供一定依据。此外，本研究提示作为影响老年癫痫患者预后不良的危险因素，血浆外泌体LncRNA MIR155HG对预后具有重要的提示作用，且当其表达量>1.171时，老年癫痫患者发生预后不良的概率可能更大。

综上，血浆外泌体LncRNA MIR155HG与血浆细胞因子水平均有一定的相关性，表明在临床诊治过程中，老年癫痫急性发作后血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平的变化可为评估病情及预后提供一定依据。但LncRNA MIR155HG水平影响老年癫痫患者预后的具体机制仍不十分明确，需进一步深入研究。且本研究样本数量较小，范围局限，需加大样本量进一步研究。