病毒性脑炎患儿血清RANTES、Eotaxin表达水平及其临床意义

郑惠心，孙嵩，陈玉雯，冯小伟

病毒性脑炎(viral encephalitis，VE)是由多种病毒毒素侵袭脑实质或软脑膜导致的神经系统感染性疾病，也是导致儿童神经功能受损或死亡的主要因素之一[1]。因此寻找合适的血清指标快速准确地评估VE的严重程度和预后对早期干预治疗至关重要。T细胞正常表达和分泌刺激因子(regulation on activation normal T-cell expressed and secreted，RANTES)可使多种白细胞活化，促进炎性反应；同时也能够抑制病毒在机体内的复制过程[2]。研究表明[3]，RANTES能够结合其特异性受体C-C趋化因子受体5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)，促进T细胞表面CD34和CD44表达；同时增强炎性细胞与感染组织细胞的黏附性，从而加速炎性反应进展。嗜酸性粒细胞趋化因子(eosinophil chemoattractant chemokine，Eotaxin)属于趋化因子C-C 家族成员，其编码基因位于17q21，在Th1和Th2型细胞膜表面表达，能够参与效应T细胞的活化、分化及迁移，诱导并促进细胞免疫的发生[4]。研究表明[5]，Eotaxin对淋巴细胞、Th2型细胞及嗜碱性粒细胞均具有较强的催化作用，并诱导以上细胞合成释放组胺，促进肥大细胞生长，分泌过敏介质，从而调节速发型过敏性炎性反应。

目前，RANTES和Eotaxin在VE中研究罕见，且对其严重程度及预后的影响尚不清楚。因此，现观察VE患儿血清中RANTES和Eotaxin的表达，并分析其与VE严重程度的关系及对预后不良的诊断效能，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年6月—2020年5月海南省人民医院儿科收治VE患儿101例作为VE组，同时选取医院同龄体检健康儿童97例作为健康对照组。VE组男60例，女41例，年龄2～11(7.05±1.81)岁；重症45例(表现为惊厥、昏迷及定向力障碍)，轻症56例(表现为头痛、发热、腹泻等非特异性症状)。健康对照组男55例，女42例，年龄3～10(7.11±1.72)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准(2017-007)，受试儿家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①符合《神经病学》[6]中对VE的诊断标准及严重程度评估；②VE病程均<7 d，且既往未经治疗；③既往3个月内无外科手术史。(2)排除标准：①先天性免疫系统缺陷者；②伴有肺炎、肾炎等其他部位急性感染者；③合并脑脓肿、结核性脑膜炎者；④2周内服用糖皮质激素或抗生素药物者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清RANTES、Eotaxin水平检测：VE患儿于入院当日、健康对照组于体检当日空腹状态下采集静脉血10 ml置于抗凝管中，离心收集上层清液，将其置于-80℃冰箱中保存。通过酶联免疫法检测血清RANTES、Eotaxin水平。

1.3.2 实验室相关指标检测：上述血清采用全自动生化分析仪(瑞士罗氏公司，型号COBAS INTEGRA 800)检测血清白细胞(WBC)计数、肌酸激酶脑型同工酶(CK-BB)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、神经元特异性烯醇化酶(neuronal specific enolase，NSE)。

1.4 预后评估 通过电话或门诊进行随访。随访时间为3个月或VE患儿死亡截止。采用格拉斯哥预后量表(Glasgow outcome scale，GOS)[7]评估VE患儿预后。死亡为1分；植物人生存状态为2分；重度残疾，日常生活不能自理为3分；轻度残疾，但是可以独立生活为4分；恢复良好，正常生活为5分。其中1～3分为预后不良，4～5分为预后良好。

2 结 果

2.1 2组受试者血清RANTES、Eotaxin比较 VE组血清RANTES、Eotaxin水平均高于健康对照组(P均<0.01)，见表1。

表1 健康对照组及VE组血清RANTES、Eotaxin水平比较

2.2 不同病情VE患儿临床资料比较 不同病情VE患儿性别、年龄、WBC比较，差异无统计学意义(P>0.05)，重症VE患儿血清CK-BB、NSE、MBP及RANTES、Eotaxin均高于轻症患儿(P均<0.01),见表2。

表2 不同病情严重程度VE患儿临床资料比较

2.3 血清RANTES、Eotaxin水平与神经损伤相关指标的相关性 VE患儿血清RANTES、Eotaxin水平与CK-BB、NSE及MBP均呈正相关(P均<0.01)，见表3。

表3 VE患儿血清RANTES、Eotaxin水平与神经损伤相关指标的相关性

2.4 影响重症VE的独立危险因素分析 二元Logistic多因素回归分析显示，血清RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP升高是重症VE的独立危险因素(P均<0.05)，见表4。

表4 二元Logistic回归模型分析重症VE的独立危险因素

2.5 血清RANTES、Eotaxin水平对VE患儿预后不良的诊断价值 以VE患儿是否发生预后不良为因变量，以上述2项指标为自变量，绘制ROC曲线。血清RANTES、Eotaxin的最佳截断值分别为300 ng/L、183.5 ng/L，AUC分别为0.784、0.761，二者联合的AUC为0.863，优于单一指标预测VE患儿发生预后不良的效能(Z=6.233、5.490，P均<0.001)，见图1、表5。

表5 血清RANTES、Eotaxin水平对预后不良VE患儿的诊断价值

图1 血清RANTES、Eotaxin水平对VE患儿预后不良的诊断价值

3 讨 论

据流行病学调查发现，我国是VE的高发国家，其年均发病率为3.5/10万～7.4/10万，以夏秋季为主，存在一定的区域性及病原谱差异。VE在初期症状较隐匿，疾病进展迅速，且临床症状多样，易导致多种脏器功能障碍，致残率较高。VE的发病机制较复杂，涉及体液免疫、细胞免疫、炎性因子、细胞因子等多种因素之间的相互作用[1]。目前，针对VE严重程度和预后的评估主要以临床症状、脑电图及脑脊液检查为主，耗时长，具有一定的误差性。因此，发现合适的生化指标对VE的病情评估及预后分析具有重要价值。

RANTES是一种长链糖蛋白，其编码基因位于17q11.2上，结构呈高度保守性，在多种细胞中均能转录合成，能够诱导多种炎性因子和细胞活化，促进局部免疫损伤[2]。动物实验表明[2]，RANTES能够诱导特异性的CD8+T细胞合成，并定向趋化移动至流感病毒侵袭组织处，促进特异性免疫反应的发生。Ajamian等[3]发现，RANTES能够促进嗜酸性粒细胞分化，并使其迁移至支气管肺泡灌洗液及上呼吸道内，加重哮喘的严重程度。本研究发现，VE组血清RANTES水平较健康儿童高，提示RANTES可能在VE发病时具有一定作用。其原因可能是病毒毒素透过血脑屏障时刺激抗原递呈细胞，经其递呈至巨噬细胞，使巨噬细胞活化，通过内质网合成分泌大量的RANTES，并释放入血，使血清中RANTES水平升高[8]。且本研究结果表明，血清RANTES随患儿病情的加重而升高，提示RANTES可能参与调控VE的进展，与Kalita等[8]的研究结果相符。其原因可能是RANTES能够激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，使其磷酸化并迁移至细胞核内，促进核转录因子κB(nclear factor-kB，NF-κB)活化，促进炎性反应进展，加重脑组织的损伤程度[9]。Dao等[10]发现，RANTES能够促进细胞因子分泌，并诱导其与信号传导及转录活化因子(signal transducers and activators of Transcription, STAT)结合，使STAT发生二聚体化，释放γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)，增强炎性反应的程度。

Eotaxin是一种β趋化因子，由72个氨基酸残基组成，由巨噬细胞和嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)合成分泌，与人膜辅助蛋白具有高度同源性，对EOS具有选择性化学趋化作用[11]。Eotaxin通过结合其特异性受体趋化因子受体3(chemokine receptor 3，CCR3)，促进干细胞分化成EOS，以滚动、黏附及渗出的方式向外周循环迁移，并作用于内皮细胞，在病毒或病菌累及的组织中大量聚集，发挥相应的生物学效应[12]。Molina-Infante等[4]发现，CCR3拮抗剂使EOS的趋化、募集受阻，迟发性变态反应的程度减轻，同时分化成EOS的比例也呈下降趋势。本研究结果表明，VE患儿血清Eotaxin水平高于健康儿童，提示Eotaxin可能参与调控VE的发病过程，这与Cui等[5]的研究结果一致。其原因可能是病毒入侵脑实质后单核细胞活化，经过信号通路转导激活NF-κB，使Eotaxin mRNA的启动子活化，启动转录翻译过程，合成Eotaxin并释放入血，提高血清中Eotaxin水平[13]。同时，重症VE患儿血清Eotaxin水平高于轻症患儿，提示Eotaxin可能在VE的进展过程中发挥一定作用。其原因可能是Eotaxin能够激活CCR3，促进EOS浸润感染组织，诱导EOS发生脱颗粒作用，合成并释放大量的蛋白酶、炎性介质及内源性刺激物，损伤脑实质，加重VE的严重程度[12,14]。此外，Eotaxin能够促进硝基酪氨酸及一氧化氮合酶合成，诱导氧化应激反应，释放活性氧，使脑膜和脑组织发生局部氧化损伤，导致病情加重[5,14]。

二元Logistic回归分析显示，血清RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP升高是重症VE的独立危险因素(P均<0.05)，提示血清中RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP水平高低是影响VE严重程度的重要因素，这对评估重症VE患儿具有重要帮助。Pearson相关分析显示，VE患儿血清中RANTES、Eotaxin水平与神经损伤指标存在相关性，可能对辅助判断神经损伤情况具有一定帮助。其原因是RANTES能够结合细胞外基质中的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，诱导肥大细胞和单核细胞经血脑屏障趋化运动至病毒侵袭的脑实质处，释放大量的炎性因子，破坏脑内血管内皮细胞，损伤脑实质细胞及神经纤维细胞，使脑神经功能受损[15-16]。Eotaxin-CCR3轴能够激活细胞外信号调节激酶2和分裂素活化蛋白激酶，诱导白介素13大量释放聚集，使神经细胞变性或凋亡，同时，促进Ca2+内流，增强肥大细胞对脑组织的黏附性及反应性，使肥大细胞产生的组胺及炎性因子直接损伤脑实质细胞及神经纤维细胞，加重脑神经功能损伤程度[17-18]。ROC曲线显示，血清RANTES联合Eotaxin能够提高VE患儿发生预后不良的诊断价值。同时，本研究还发现，RANTES联合Eotaxin的敏感度和特异度均较高，弥补了单一指标敏感度或特异度不高的缺陷，提示2指标联合应用对早期评估VE患儿发生预后不良具有较高预测价值。

总之，VE患儿血清中RANTES和Eotaxin均升高，且是重症VE的独立危险因素。同时，血清中RANTES和Eotaxin水平能够在一定程度上反映神经功能受损程度。血清RANTES联合Eotaxin对VE患儿发生预后不良具有良好的诊断效能，且诊断的真实性可靠，为临床实施进一步治疗提供有利支持。但由于试验设备及试验条件有限，VE患儿血清中RANTES和Eotaxin变化的具体机制尚不清楚，需要在接下来的基础实验中逐步证实。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

郑惠心：提出研究方向、研究思路，设计研究方案，论文撰写；孙嵩：提出研究思路，数据收集，分析整理，进行统计学分析；陈玉雯：实施研究过程，参与文献调研与整理；冯小伟：设计研究方案，参与实施研究过程，论文修改